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文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

天冬酰胺連接（N－連接）蛋白糖基化是真核生物中最常見的翻譯后修飾之一，它影響著蛋白質(zhì)的特性，如折疊、穩(wěn)定性、免疫原性和藥代動力學(xué)。附著在糖蛋白的N－聚糖可以參與生物過程，如免疫識別反應(yīng)和干細胞分化。而且，蛋白質(zhì)相關(guān)聚糖的改造工程可用于操縱蛋白相關(guān)的修復(fù)特性，如增強胞內(nèi)的活性和半衰期。

目前，聚糖固有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性、生產(chǎn)糖基化蛋白的潛在困難，限制了人們對糖蛋白功能的研究進展。此外，由于聚糖的生物合成既不是模板驅(qū)動的，也不是基因編碼的，因此聚糖不能通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。相反，N－聚糖是通過多個糖基轉(zhuǎn)移酶在多個亞細胞室中的協(xié)調(diào)表達而自然產(chǎn)生的。這種生物合成模式加上缺乏嚴(yán)格的校對系統(tǒng)，導(dǎo)致了固有的聚糖異質(zhì)性，并造成了細胞或生物體所表達的聚糖庫中結(jié)構(gòu)的巨大多樣性。而更復(fù)雜的問題是，糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究相對缺乏，這就是的聚糖結(jié)構(gòu)預(yù)測及其生物合成更加困難。

近年來，細菌糖工程這一研究方向的再次興起，使得生產(chǎn)設(shè)計聚糖和糖綴合物作為疫苗和治療方法逐漸成為可能。然而，由于細胞活力的限制和無法在體內(nèi)以精確的比例控制糖基化成分，基于細胞的糖蛋白生產(chǎn)困難重重。

目前，最具特征和最廣泛采用的無細胞蛋白合成系統(tǒng)（CFPS）系統(tǒng)是使用大腸桿菌裂解物來實現(xiàn)體外蛋白質(zhì)合成，但因為大腸桿菌缺乏內(nèi)源性糖基化機制，這些CFPS系統(tǒng)無法制造糖蛋白。

一些真核CFPS系統(tǒng)中可以進行糖基化，包括昆蟲細胞、雜交瘤細胞或哺乳動物細胞等。然而，這僅限于進行糖基化的內(nèi)源性機制。此外，真核生物的CFPS系統(tǒng)在技術(shù)上難以制備，通常需要補充微粒體，并且由于新生多肽鏈向微粒體的運輸效率低下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和糖基化產(chǎn)量效率低下。

2018年美國西北大學(xué)的Thapakorn Jaroentomeechai在《Nature Communications》（中科院一區(qū)，IF＝14．919）發(fā)表題為“Single－pot glycoprotein biosynthesis using a cellfree transcription－translation system enriched with glycosylation machinery”的文章。這項工作研究了一種新的無細胞糖蛋白合成（CFGpS）技術(shù)，該技術(shù)無縫地將蛋白質(zhì)生物合成與天冬酰胺連接的蛋白糖基化相結(jié)合。該技術(shù)利用優(yōu)化了的富含糖鏈的大腸桿菌細胞提取物，選擇性地富集糖基化成分，包括寡糖轉(zhuǎn)移酶（OSTs）和脂聯(lián)寡糖（LLOs）。所得到的提取物可以進行一鍋式的的高效反應(yīng)并且進行位點特異性的糖基化。

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

基于大腸桿菌的無細胞翻譯系統(tǒng)具有開放性，使得糖蛋白在CFPS的合成具有可能性。該小組最近的一項研究在基于大腸桿菌的CFPS中通過純化的糖基化組分實現(xiàn)了N－糖基化途徑，使大腸桿菌的無細胞系統(tǒng)具有合成糖蛋白的能力。

雖然這些結(jié)果建立了基于大腸桿菌提取物生產(chǎn)糖蛋白的可能性，但使用純化的糖基化成分存在幾個缺陷，限制了系統(tǒng)的效用。首先，糖基化成分的制備需要耗時且成本高昂的步驟，即純化多通道跨膜寡糖轉(zhuǎn)移酶和基于有機溶劑從細菌膜中提取脂聯(lián)寡糖供體。這些步驟大大延長了工藝開發(fā)時間，準(zhǔn)備LLO和OST組件各需要3－5天，需要熟練的操作人員和專業(yè)設(shè)備，導(dǎo)致產(chǎn)品必須冷藏，只能穩(wěn)定幾個月到一年。糖蛋白生產(chǎn)順序需要遵循先翻譯后糖基化這一策略，這需要20小時的靶蛋白合成，另外12小時的翻譯后蛋白糖基化。在這里，本文通過開發(fā)一種集成的無細胞糖蛋白合成（CFGpS）技術(shù)來解決這些缺陷，該技術(shù)繞過了OSTs的純化和基于有機溶劑的LLOs提取的需要。這種流水型CFGpS系統(tǒng)的創(chuàng)建是由于兩個重要的發(fā)現(xiàn)：（1）從優(yōu)化的大腸桿菌菌株CLM24中提取的粗提物能夠支持無細胞蛋白表達和N－連糖基化；（2）從CLM24中提取的OST和富含LLO的提取物能夠重復(fù)地共激活蛋白質(zhì)合成和N－糖基化，該反應(yīng)混合物至少需要用編碼目標(biāo)糖蛋白的DNA啟動。重要的是，CFGpS系統(tǒng)分離了糖蛋白合成成分（即OSTs、LLOs、翻譯機制）和感興趣的糖蛋白靶點的產(chǎn)生，與體內(nèi)系統(tǒng)相比，顯著降低了細胞活力的限制。最終的結(jié)果是獲得了一個一鍋式細菌糖蛋白生物合成平臺，通過這個平臺，不同的受體蛋白、OSTs或寡糖結(jié)構(gòu)可以在功能上進行交換，并可為糖基化的形成定制原型。本研究建立的CFGpS將促進糖科學(xué)的進一步理解，并在糖蛋白的按需生物制造方面得以應(yīng)用。

       原文標(biāo)題 : 無細胞系統(tǒng)+糖基化機制，實現(xiàn)“一鍋式”糖蛋白生物合成