前言

近年來，細胞內靶向蛋白降解（iTPD）已成為小分子藥物開發(fā)的一種重要的新模式。第一類稱為蛋白質水解靶向嵌合體（PROTACs），通過構建雙功能小分子，募集感興趣的藥物靶蛋白（POI）和用于蛋白酶體降解的E3連接酶，通過蛋白酶體降解。第二類被稱為分子膠，分子膠增強了E3連接酶和POI之間的相互作用，導致其泛素化和蛋白酶體降解。

與傳統(tǒng)的抑制劑相比，iTPD具有顯著的優(yōu)勢。首先，PROTAC或分子膠理論上可以結合POI上的任何地方，而抑制劑通常需要結合到活性或變構位點。其次，靶標的降解會去除整個蛋白質，包括其支架功能，因此該藥物的治療活性應該持續(xù)更長時間，更接近基因敲除實驗的結果。第三，這些分子以催化作用，而不是像經(jīng)典的藥理學抑制劑以化學計量作用，因此較低的劑量可以達到相同的治療效果。

iTPD的進展啟發(fā)了生物學和化學界以細胞外蛋白質為靶點，稱之為細胞外TPD（eTPD）。除了目標POI的位置之外，iTPD和eTPD之間至少有三個顯著的區(qū)別。首先，細胞通過兩個主要途徑回收蛋白質：蛋白酶體和溶酶體途徑。iTPD幾乎只通過蛋白酶體途徑，該途徑通常用于處理細胞內蛋白質。eTPD涉及雙特異性生物大分子或小分子，它們將膜結合或分泌的POI募集到膜結合循環(huán)受體，并將POI輸送到溶酶體，這是細胞外蛋白降解的典型途徑。

其次，這兩種蛋白水解破壞模式具有不同的動力學，并使用不同的蛋白酶。iTPD更快——通常在幾分鐘到幾個小時內，因為所有成分都在細胞內。相比之下，eTPD的速度通常較慢，通常在6–48小時，因為它涉及從膜通過早期和晚期內體的囊泡運輸，并最終與溶酶體融合導致蛋白質降解。

第三，幾乎所有的iTPD系統(tǒng)都只使用少數(shù)E3連接酶，主要是cereblon（CRBN）或von Hippel–Lindau（VHL），在尋找E3連接酶結合物方面存在挑戰(zhàn)。這兩種連接酶在組織中廣泛表達，這限制了組織選擇性靶向。相比之下，eTPD可以使用了多種降解系統(tǒng)，這允許更特異的組織選擇性。最后，與典型的小分子相比，抗體的藥代動力學非常長，因此給藥頻率較低。因此，eTPD代表了一種新興的生物藥開發(fā)的新模式。

eTPD的優(yōu)勢

對于已有的生物藥模式來說，生物藥領域似乎已經(jīng)有足夠多的選擇，如抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、雙特異性T細胞結合器或嵌合抗原受體（CAR）-T細胞。eTPD不太可能取代殺死癌細胞的高效方式。然而，已有的模式均有局限性，例如ADC的毒性載荷造成的附帶損害，或誘導CAR-T細胞的細胞因子風暴，以及生產(chǎn)和給藥挑戰(zhàn)。此外，這些治療方式僅限于膜POI，也主要用于腫瘤學中急性的危及生命的疾病。

最接近eTPD的比較物是通過功能性阻斷POI發(fā)揮作用的裸抗體。抗體和eTPD都可以作用于可溶性或膜結合的靶標。然而，eTPD可能具有顯著優(yōu)勢。首先，與通過化學計量結合阻斷功能的抗體相比，eTPD可以催化降解靶標。因此，原則上，eTPD可以減少所需的劑量，當POI大量存在時，這可能是一個顯著的優(yōu)勢。其次，eTPD和其他降解機制不僅可以完全阻斷POI的單個活性位點的功能，還可以完全阻斷整個蛋白質的功能，確保任何潛在的功能都被消除。事實上，在eTPD中消除了靶向功能位點，為淀粉樣蛋白等打開了靶表位空間。

另一個可能不太明顯的優(yōu)點是，與長半衰期抗體的隨機結合可以產(chǎn)生低水平的毒性POI，尤其是對于可溶性POI。例如，已知治療性抗體貝伐單抗顯著增加可溶性靶標血管內皮生長因子（VEGF）的循環(huán)半衰期。IL-6和其他幾種與細胞因子或生長因子結合的抗體也出現(xiàn)了同樣的情況。即使是少量的緩沖效應也可能產(chǎn)生矛盾的后果。在一個最早的例子中，人們發(fā)現(xiàn)人類生長激素受體天然脫落的胞外結構域（hGHbp）顯著提高hGH的半衰期，并能增強hGH活性。因此，與簡單的結合導致功能阻斷相比，致病POI的eTPD降解可能具有顯著的藥理學優(yōu)勢。

降解可溶性POI的清除抗體

抗體的Fc區(qū)對抗體回收和免疫細胞活化具有重要功能。新生兒Fc受體（FcRn）負責回收內化的抗體，在抗體到達溶酶體降解之前將其送出細胞，增強抗體與FcRn的結合可以將其在人類中的血清半衰期延長。

通過巧妙地設計，可以使工程化抗體通過FcRn以pH可切換的方式將POI遞送到酸性內體，酸性內體釋放POI進行溶酶體降解。Tocilizumab（Tcz），這是一種被批準用于治療類風濕性關節(jié)炎的人源化抗體，與IL-6受體（IL-6R）具有pH依賴性結合。通過將Tcz重新設計成清除抗體，利用已知的突變提高了其對FcRn的親和力，然后通過CDR的突變在pH6.0的情況下將對IL-6的親和力降低約20倍，同時在pH 7.4保持親和力。修飾的抗體可以將IL-6R輸送到溶酶體，同時保持與FcRn的連接，并循環(huán)回質膜以收集更多的IL-6。這將猴子的血清半衰期從1周提高到1個月。

研究表明，pH可切換抗體清除IL-6R所需的劑量比母抗體低20倍，且允許皮下注射，而不需靜脈輸注。pH可切換的Tocilizumab于2020年被批準用于治療視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙，這代表了eTPD中第一個被批準的抗體。

基于聚糖的循環(huán)受體eTPD

使用聚糖靶向的再循環(huán)受體，如陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體（CI-M6PR）或去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR），可以促進膜和可溶性POI的溶酶體降解。一種方法涉及CI-M6PR的多個聚糖配體與靶向POI的抗體的生物偶聯(lián)，稱為溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）。LYTAC–POI復合物與CI-M6PR結合后被內化，導致POI在溶酶體中降解。另一種方法被稱為MoDE或ASGPR靶向嵌合體（ATACs）的雙功能小分子，被用于開發(fā)基于ASGPR的類似方法。

CI-M6PR是一個300 kDa二聚體I型受體，是pH可切換受體，其在中性pH下與配體結合，并在內涵體與溶酶體融合之前在酸性內涵體中釋放。CI-M6PR已被用于將攜帶M6P的外源性溶酶體酶穿梭到溶酶體，以治療溶酶體疾病。一項研究將6至8個含有甘露糖6-磷酸酯（M6Pn）的不可水解聚糖隨機偶聯(lián)到POI靶向抗體的賴氨酸殘基上，以產(chǎn)生潛在的eTPD。研究表明，聚糖標記的mCherry或ApoE4抗體可以10到100倍的速率比非特異性對照更快地吸收這些可溶性配體。

ASGPR主要在肝細胞上高表達，并可快速清除非唾液酸化糖蛋白。一項研究證明，約10個拷貝的tri-GalNac與POI結合抗體的生物偶聯(lián)可用于降解各種治療上感興趣的蛋白質。HEPG3細胞中高達70%的EGFR在24-48小時后被降解、 這與基于CI-M6PR的LYTAC的結果相當。

總之，基于聚糖的eTPD降解方法主要利用ASGPR或CI-M6PR。它們具有非常不同的組織分布；ASGPR在肝臟中高表達，而CI-M6PR更廣泛地表達，但主要在免疫細胞中。事實上，聚糖對降解臂的親和力本質上低于抗體，這需要多個糖單元和高水平的偶聯(lián)。這可能在CMC上會有巨大挑戰(zhàn)。但是盡管如此，這兩種基于聚糖的降解系統(tǒng)提供了去除膜和可溶性蛋白質的令人興奮的途徑。

基于跨膜E3連接酶靶向膜蛋白的eTPD

E3連接酶除了600–700個細胞內的成員外，還有一個約包含30多個成員的含有跨膜結構域的E3連接酶家族。利用靶向該家族成員和POI的雙特異性抗體可以降解靶蛋白，被稱為AbTACs或PROTAB。該家族中最具特征的成員之一是RNF43，RNF43是一種783殘基的1型蛋白，包含一個200個氨基酸的胞外結構域，隨后是一個跨膜結構域和一個包含E3連接酶RING結構域的胞內結構域。另一種同源物ZNRF3，具有與RNF43不同的組織分布。

一項研究構建了一種PD-L1的AbTAC，POI臂選擇與PD-L1結合的atezolizumab的Fab結構域，降解臂使用RNF43胞外結構域的Fab。Atz-AbTAC采用了經(jīng)典的KIH模式，Atz AbTAC誘導了PD-L1的降解，DC50為3.4nM，24小時最大降解（Dmax）約為63%，全細胞蛋白質組學顯示細胞蛋白質組沒有顯著的總體變化，也沒有顯著的細胞毒性。

此外，有研究探索與跨膜E3連接酶家族結合的VHH，包括RNF43和ZNRF3，以及其他三種連接酶，RNF128、RNF130和RNF167，他們稱之為通過E3泛素連接酶募集（REULR）的消除受體。研究發(fā)現(xiàn)，一些含有cetuximab-Fab臂的REULR抑制了A431細胞中75%的細胞增殖。一家新的初創(chuàng)公司InDuPro目前專注于REULR技術。

總之，已有研究表明，與跨膜E3泛素連接酶家族成員（包括RNF43、ZNRF3、RNF128、RNF130和RNF167）的雙特異性分子（AbTACs、PROTABs和REULRs）可以共同選擇降解一些重要的膜蛋白，如EGFR、HER2、IGF1R、PD-L1和PD1，從而達到治療目的。

基于細胞因子靶向膜蛋白的eTPD

眾所周知，許多細胞因子可以通過穿梭到溶酶體而被其受體吸收和降解。這為利用eTPD的內源性機制提供了另一個機會，方法稱為細胞因子受體靶向嵌合體（KineTAC）。

這種方法的第一個例子利用了誘餌循環(huán)受體CXCR7，其內化其配體CXCL12，而無需下游信號。一項研究利用CXCL12構建了atezolizumab-KineTAC，體外試驗顯示，24小時后觀察到PD-L1水平相對于同種型對照降低約70%、48小時后降解率高達84%。類似的結果也體現(xiàn)在包含HER2抗體的trastuzumab -KineTAC，在MDA-MB-175VII細胞上降解HER2在24小時達到60%。

與AbTAC一樣，KineTAC可以降解多種細胞類型上的廣泛膜蛋白。而且與LYTAC類似，它們也可以降解可溶性蛋白，因為循環(huán)不依賴于泛素化。KineTAC似乎對降解受體起催化作用，因為研究表明，CXCR7水平在PD-L1或EGFR降解過程中不會改變。此外，POI的轉錄水平可以顯著高于降解物，并且仍然可以有效降解。

基于整合素的eTPD

受利用整合素αVβ3靶向遞送抗癌藥物的啟發(fā)，eTPD引入了基于整合素的降解系統(tǒng)。這些細胞粘附分子作為細胞-細胞外基質連接的關鍵介質，通常在癌癥中過表達�；�于整合素是非常有吸引力的降解系統(tǒng)，因為它們能夠與含有簡單Arg-Gly-Asp（RGD）基序的配體結合并將其轉運到溶酶體。

作為原理證明，使用整合素αVβ3-結合生物素嵌合體靶向生物素結合蛋白NeutrAvidin。該分子含有與生物素共價連接的環(huán)狀RGD基序（cRGD），在20 h內成功內化A549細胞中的NeutrAvidin。此外，NeutrAvidin的內化與Lyso Tracker共定位，并可被溶酶體抑制劑阻斷。BMS-8是一種與PD-L1結合的小分子，BMS-8 cRGD 嵌合體在異種移植物小鼠模型中，與單獨的BMS-8相比，顯著減少了體重減輕、腫瘤生長和脾臟轉移。總體而言，這種基于整合素的降解系統(tǒng)為膜或可溶性蛋白的腫瘤選擇性降解顯示了令人興奮的潛力。

從內部降解膜蛋白的eTPD

受體酪氨酸激酶（RTK）已有PROTAC靶向的研究，該PROTAC含有與各種RTK抑制劑連接的CRBN或VHL的經(jīng)典E3連接酶結合物。C4Therapeutics還開發(fā)了一種EGFR小分子降解劑（L858R）CFT8919，該藥物已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的研究新藥批準。

與單獨的抑制相比，受體的降解顯示出幾個優(yōu)點。與對照相比，PROTAC對MET在降低細胞活力方面更有效，并且在沖洗后反應持續(xù)，表明反應持久。此外，降解誘導了較少的激酶重新布線，這是RTKs經(jīng)典抑制劑的常見抗性機制。降解機制被證明是完全依賴于蛋白酶體的，并且出乎意料地不依賴于網(wǎng)格蛋白。

總之，研究表明，使用與VHL或CRBN結合的PROTAC可以從內部降解RTK。降解動力學比其他PROTAC稍慢，就IC50值而言，PROTAC化合物的效力不如生物制劑，并且似乎受到進入細胞內連接酶所需的細胞滲透的顯著限制。盡管仍處于初級階段，但使用靶向膜蛋白細胞內結構域的PROTAC已顯示出應用潛力。

小結

eTPD領域尚處于起步階段，仍有許多重要問題需要解決。eTPD在哪些靶標方面具有明顯優(yōu)勢？最重要的POI是什么？在哪些治療領域？這些對慢性病或急性病更有用嗎？eTPD主要針對可溶性或膜POI，還是同時針對兩者？安全有效的eTPD藥物的組織選擇性有多重要？ eTPD將形成什么類型的耐藥性機制，與其他藥物模式相比，對eTPD藥物的耐藥性是否更可能出現(xiàn)？這些問題亟待解答。

在某些方面，eTPD讓人想起飛機的發(fā)展過程。早期人們設計了許多巧妙的飛行器，包括人形或電動的鳥類裝置，以及多翼和固定翼飛機。盡管存活下來的設計很少，但多樣性對于推進技術并最終實現(xiàn)成功設計的廣泛商業(yè)化至關重要。對于eTPD領域來說，這是一個激動人心的時刻，預計未來還會有更多的發(fā)現(xiàn)。

參考文獻：

1.Extracellulartargeted protein degradation: an emerging modality for drug discovery. Nat RevDrug Discov.2023 Dec 7

       原文標題 : 細胞外靶向蛋白降解：藥物發(fā)現(xiàn)的新模式