前言

嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法是一種過繼細(xì)胞療法，自體T細(xì)胞通過基因工程表達(dá)CAR以特異性殺死腫瘤細(xì)胞。自體CD19靶向CAR-T細(xì)胞目前已獲得大多數(shù)主要監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，包括美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）和中國(guó)NMPA。這些CAR-T細(xì)胞改變了臨床實(shí)踐，顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，

然而，在實(shí)體瘤患者中開發(fā)具有臨床實(shí)用性的CAR-T細(xì)胞仍然面臨重重困難，原因在很大程度上是未知的。有許多可能的原因，包括：（1）特異性不足的靶抗原；（2） 遞送不力；（3） 短持續(xù)性；（4） 效應(yīng)器功能喪失；和（5）腫瘤抗原異質(zhì)性。

因此，有必要從過往的CAR-T臨床前和臨床研究中汲取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，分析CAR-T細(xì)胞技術(shù)的要素和挑戰(zhàn)，并將基礎(chǔ)、臨床和實(shí)踐等方面的因素考慮在內(nèi)，采取應(yīng)對(duì)策略，從而使CAR-T技術(shù)能夠成為可負(fù)擔(dān)的治療模式。

了解CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中失敗的原因

遞送不力

CAR T細(xì)胞研究和開發(fā)中需要回答的兩個(gè)基本問題是，T細(xì)胞在靜脈注射后會(huì)去哪里，以及是它們進(jìn)入腫瘤的有效性。

模型的臨床前數(shù)據(jù)表明，很少有注射的CAR-T細(xì)胞最初進(jìn)入腫瘤，注射到同基因小鼠體內(nèi)的小鼠T細(xì)胞只持續(xù)幾周。人體的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，CAR-T細(xì)胞最初在肺部和次級(jí)淋巴器官中積累，然后在接下來的24-48小時(shí)內(nèi)非常低效地轉(zhuǎn)移到腫瘤中。

CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤首先需要識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞表面分泌并結(jié)合的趨化因子，內(nèi)皮細(xì)胞主要位于腫瘤間質(zhì)中，而不是腫瘤細(xì)胞富集區(qū)。這種最初的內(nèi)皮識(shí)別之后是由選擇素介導(dǎo)的滾動(dòng)粘附，然后是整合素的牢固粘附。在趨化因子（特別是CXCL9、CXCL10、CXCL11以及CCL5）的驅(qū)動(dòng)下，T細(xì)胞然后遷移到腫瘤基質(zhì)中。在這里，血管周圍細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（主要是成纖維細(xì)胞）組成了屏障。一些T細(xì)胞通過間質(zhì)遷移，更少的T細(xì)胞最終在腫瘤衍生趨化因子的引導(dǎo)下進(jìn)入腫瘤細(xì)胞富集區(qū)，在那里它們可以殺死腫瘤細(xì)胞，這一過程需要與腫瘤細(xì)胞上的ICAM1結(jié)合。這一過程效率極低，導(dǎo)致很少的T細(xì)胞成功地與腫瘤細(xì)胞相互作用。這里存在許多缺乏效率的原因，包括趨化因子-CCR失配、粘附受體缺陷和充當(dāng)屏障的細(xì)胞外基質(zhì)。

另一個(gè)重要但被低估的問題可能是CAR-T細(xì)胞向淋巴組織和遠(yuǎn)離實(shí)體瘤的“誤導(dǎo)”。到目前為止，CAR T細(xì)胞的制造主要受到在B細(xì)胞白血病或淋巴瘤患者中測(cè)試CD19靶向產(chǎn)品的試驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)指導(dǎo)，這些試驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了淋巴結(jié)和/或骨髓運(yùn)輸、抗腫瘤活性的擴(kuò)展和持久性的重要性。已知具有高水平CCR7和CD62L表達(dá)的T細(xì)胞優(yōu)先運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié)或骨髓。因此，大多數(shù)當(dāng)前方案的目標(biāo)是產(chǎn)生主要具有中樞記憶細(xì)胞（CD62L高和CCR7高CD45RO+）表型的CAR-T細(xì)胞，而不是效應(yīng)記憶細(xì)胞（CD 62L低和CCR7-低CD45RO++）表型，這通常不利于向腫瘤的轉(zhuǎn)移。

此外，應(yīng)考慮另外兩個(gè)注意事項(xiàng)。首先，冷凍保存可能會(huì)影響CD62L的表達(dá)，從而影響運(yùn)輸。其次，CD62L被認(rèn)為通過其他機(jī)制促進(jìn)抗腫瘤活性，具體而言，CD62L可能引導(dǎo)T細(xì)胞向某些實(shí)體瘤中存在的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)的高內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈運(yùn)輸。這些淋巴結(jié)構(gòu)可能促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)，并改善抗腫瘤免疫反應(yīng)。

短持久性

在涉及實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)中，就CAR-T細(xì)胞的持久性而言，使用PCR或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，迄今為止進(jìn)行的幾乎每一項(xiàng)試驗(yàn)都顯示CAR-T細(xì)胞僅存在于血液樣本中。血液中CAR T細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄物的范圍為每微克DNA103至104個(gè)拷貝，輸注后僅在約一個(gè)月內(nèi)檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞，峰值通常出現(xiàn)在10-14天。相比之下，在白血病患者中測(cè)試CD19靶向CAR-T細(xì)胞的大多數(shù)成功試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)，血液中有大量的CAR-T細(xì)胞，通常為每微克DNA 105-106個(gè)拷貝，其持續(xù)時(shí)間從幾個(gè)月到幾年不等。

總之，臨床前和臨床研究的結(jié)果表明，靜脈注射后，CAR-T細(xì)胞向腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)效率非常低，而且大多數(shù)這種轉(zhuǎn)運(yùn)可能在注射后不久發(fā)生。從人類研究中獲得的有限數(shù)據(jù)表明，進(jìn)入實(shí)體瘤的少數(shù)CAR-T細(xì)胞具有有限的持久性，并且不會(huì)廣泛增殖。

效應(yīng)器功能喪失

CAR-T細(xì)胞的臨床前研究一致發(fā)現(xiàn)，它們的細(xì)胞毒性活性最初很高，但隨著時(shí)間的推移逐漸降低�；�因組和表觀基因組的變化都與這種低功能狀態(tài)有關(guān)。誘發(fā)這種進(jìn)行性功能減退狀態(tài)的原因尚不完全清楚。可能與TME中存在的多種因素相關(guān)，包括低pH、缺氧、由于關(guān)鍵氨基酸和葡萄糖水平低而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)缺乏、高水平的活性氧（ROS）、免疫抑制介質(zhì)（如TGF-β、PGE2、腺苷和IL-10）的存在，以及與骨髓來源的抑制細(xì)胞和CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相互作用。T細(xì)胞內(nèi)在因素包括由免疫檢查點(diǎn)（如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3）和抑制性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路（如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b）介導(dǎo)的“調(diào)節(jié)性關(guān)閉”。此外，還有多種表觀遺傳學(xué)變化。

腫瘤異質(zhì)性與抗原擴(kuò)散

與B細(xì)胞惡性腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤不同，實(shí)體瘤中的抗原表達(dá)幾乎總是較低且更異質(zhì)。因此，除非CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)某種旁觀者或抗原擴(kuò)散效應(yīng)，或靶向多種抗原，否則成功治療的可能性很低。

我們可以汲取的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)

某些實(shí)體瘤患者現(xiàn)在可以使用過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移成功治療，其中最顯著的成功是黑色素瘤患者的TIL治療。在非小細(xì)胞肺癌患者中使用TIL也取得了有希望的結(jié)果。我們可以從這些成功中學(xué)到什么，以使CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中取得更大的成功？

針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移優(yōu)化的T細(xì)胞可能不是針對(duì)實(shí)體瘤的最佳細(xì)胞

與優(yōu)先運(yùn)輸至外周位點(diǎn)的效應(yīng)細(xì)胞或效應(yīng)記憶細(xì)胞相比，CD62L和CCR7在幼稚或中央記憶T細(xì)胞上的高表達(dá)能夠優(yōu)先運(yùn)輸至次級(jí)淋巴結(jié)和骨髓。當(dāng)用于開發(fā)靶向?qū)嶓w瘤的CAR-T細(xì)胞時(shí)，這些表型的細(xì)胞可能是次優(yōu)的。實(shí)體瘤導(dǎo)向的CAR-T細(xì)胞被設(shè)計(jì)為靶向在實(shí)體瘤細(xì)胞表面表達(dá)的完整抗原。因此，當(dāng)這些細(xì)胞進(jìn)入骨髓或淋巴結(jié)時(shí)，它們將不會(huì)遇到它們的抗原，因此不會(huì)被激活以增殖或分化為效應(yīng)細(xì)胞，除非腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到這些位置。數(shù)據(jù)顯示，在實(shí)體瘤模型中，效應(yīng)器CAR-T細(xì)胞比記憶T細(xì)胞更有效。因此，使用旨在優(yōu)化淋巴結(jié)運(yùn)輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方案產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞可能是實(shí)體瘤需要避免的一個(gè)關(guān)鍵教訓(xùn)。

DC交互可能很重要

TIL或TCR-T細(xì)胞和CAR T細(xì)胞之間的一個(gè)重要區(qū)別是前者可以被DC廣泛激活，DC可以提供最佳的共刺激信號(hào)。這種共刺激可以發(fā)生在淋巴結(jié)和骨髓中。找到利用DC激活能力的方法，以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖和持續(xù)的能力，是我們應(yīng)該嘗試從涉及TIL的試驗(yàn)中吸取的經(jīng)驗(yàn)。

可能不需要長(zhǎng)期持久性

普遍認(rèn)為，CAR-T細(xì)胞的成功與CAR-T細(xì)胞的持久性密切相關(guān)。然而，由于多種原因，在實(shí)體瘤患者中測(cè)試CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中，持久性的重要性尚未得到證實(shí)。此外，來自實(shí)體瘤模型的數(shù)據(jù)表明，CAR-T細(xì)胞的持久性與T細(xì)胞功能低下水平的增加有關(guān)。

解決這一難題的方法如修飾CAR-T細(xì)胞，使其更持久，更不易發(fā)生功能低下。過去幾年，使用這種方法在實(shí)體瘤患者中取得了一些令人鼓舞的成功。然而，另一種需要考慮的方法是不考慮持久性，而是使用多次給藥策略給予新鮮的CAR-T細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，注射的CAR-T細(xì)胞會(huì)耗盡，它們可以被新劑量的高活性CAR-T細(xì)胞取代。這種方法減少CAR成分的免疫原性是必要的，以避免多次給藥的細(xì)胞被排斥。

靶向多種腫瘤抗原很重要

除了激活機(jī)制的差異外，TIL和CAR-T細(xì)胞之間的一個(gè)重要差異是，前者本質(zhì)上是多克隆的，因此可能靶向不止一種抗原。任何成功治療實(shí)體瘤患者的CAR-T細(xì)胞療法都需要靶向多個(gè)腫瘤特異性靶點(diǎn)，最佳地觸發(fā)某種旁觀者效應(yīng)或誘導(dǎo)抗原擴(kuò)散到內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。例如，通過設(shè)計(jì)分泌FLT3配體的CAR-T細(xì)胞對(duì)DC的募集，以及使用4-1BB激動(dòng)劑的DC激活，以促進(jìn)內(nèi)源性T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤活性增強(qiáng)。

如何更好地開發(fā)CAR-T

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，可以考慮通過優(yōu)化兩種不同的策略來向前邁進(jìn)，以在實(shí)體瘤患者中取得更大的成功。策略1是該領(lǐng)域的當(dāng)前方向，基于為血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者開發(fā)的傳統(tǒng)“記憶細(xì)胞”模式。策略2采用不同的“短命效應(yīng)細(xì)胞”模式。

策略1：記憶細(xì)胞模式

這種方法的目標(biāo)是最大限度地提高CAR-T細(xì)胞的運(yùn)輸和持久性，同時(shí)最大限度地降低CAR T功能低下的程度。作為策略的一部分，大劑量化療的淋巴結(jié)清除用于增強(qiáng)植入。CAR-T細(xì)胞的持久性和低功能已經(jīng)通過向T細(xì)胞引入特定的遺傳改變（如通過CRISPR）來抑制可能的抑制因子來解決，允許T細(xì)胞“休息”，從而防止慢性刺激，或直接通過使用能夠分泌細(xì)胞因子或其他蛋白質(zhì)的武裝CAR-T細(xì)胞來改變TME。

與該策略相關(guān)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是需要引入多種基因改變。在過去的幾年里，許多研究已經(jīng)能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的CRISPR技術(shù)敲除一個(gè)或多個(gè)基因，并且開發(fā)了許多更先進(jìn)的CRISPR技術(shù)，能夠以非常低的脫靶突變率進(jìn)行高效的基因編輯。

衍生自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的異基因T細(xì)胞的開發(fā)也可以提供一種替代方法，通過允許進(jìn)行多種遺傳改變來改善CAR-T細(xì)胞的運(yùn)輸和持久性。iPSC將首先使用各種CRISPR引導(dǎo)物進(jìn)行修飾，從而能夠敲低選定的基因，使細(xì)胞具有低免疫原性，然后使用能夠敲低T細(xì)胞功能的選定關(guān)鍵抑制劑的引導(dǎo)物。在選擇具有所有預(yù)期改變的克隆后，可以添加額外的基因來增強(qiáng)運(yùn)輸或功能。

策略2：短命效應(yīng)細(xì)胞模式

盡管沒有得到很好的研究，但一些數(shù)據(jù)支持在實(shí)體瘤小鼠模型中使用壽命更短、更像效應(yīng)器T細(xì)胞的優(yōu)越性。例如在對(duì)間皮素靶向CAR-T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，具有CD28–CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（更像效應(yīng)器）的細(xì)胞比具有4-1BB–CD3z胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞具有更好的抗腫瘤活性。

鑒于持久性不是目標(biāo)，策略2也可能使用mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR T細(xì)胞。這種方法的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是對(duì)轉(zhuǎn)基因的大小沒有限制，可以通過電穿孔引入一種以上的mRNA并同時(shí)表達(dá)，從而能夠引入多種遺傳變異。

然而，使用這種方法制備的mRNA–CAR-T細(xì)胞的一個(gè)潛在限制是，與策略1中的“一次性”方法相比，必須隨時(shí)間給藥多劑量CAR-T細(xì)胞的成本問題。盡管患者需要再次輸注，但這與化療或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的給藥類似，通常每4-6周給藥一次，有時(shí)會(huì)持續(xù)多年。

小結(jié)

解決CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤患者中的應(yīng)用所面臨的眾多挑戰(zhàn)是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。目前的治療方法對(duì)實(shí)體瘤患者基本無效，其中的原因我們并沒有完全理解。獲得更多更好的關(guān)于CAR-T細(xì)胞在接受治療的患者中的運(yùn)輸、持久性和功能的信息對(duì)于解決這些方面的問題至關(guān)重要。

治療成功的大量障礙可能需要多種免疫逃避機(jī)制的共同靶向。這些策略將包括使用CAR工程的優(yōu)化，在離體T細(xì)胞擴(kuò)增過程中優(yōu)化條件以促進(jìn)特定T細(xì)胞亞型的出現(xiàn)，以及操縱宿主以改變TME或刺激天然T細(xì)胞，可能需要使用所有這些方法來實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

1.CART cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn andunlearn. Nat Rev Clin Oncol.2023 Oct 30

       原文標(biāo)題 : 實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞治療：關(guān)鍵的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)