前言

哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如 CHO 細(xì)胞）中產(chǎn)生的治療性單克隆抗體（mAb）和 Fc 融合蛋白（本文中稱為 mAb），往往存在病毒污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。下游純化工藝除了要去除目標(biāo)抗體外的其他雜質(zhì)外，還需對(duì)潛在的內(nèi)源性和外源性病毒進(jìn)行有效的清除（去除或滅活）。層析法、病毒滅活和納濾三個(gè)步驟相結(jié)合通�？捎行У那宄�病毒。而層析法中，ProteinA 層析和精純層析步驟都可以在一定程度上去除病毒。

病毒清除研究主要采用縮小模型柱進(jìn)行，通常是在層析柱中加載病毒，通過初始加載的病毒量與層析后樣品中的病毒量計(jì)算病毒清除率（LRV，通常用對(duì)數(shù)減少值表示），LRV越大則清除效果越好。整個(gè)純化過程的病毒清除率是所有單元操作的病毒清除率的加和。早期階段，病毒清除研究通常使用異嗜性鼠白血病病毒（X－MuLV）和小鼠細(xì)小病毒（MVM），兩種病毒的相關(guān)信息見表1。研究發(fā)現(xiàn)，病毒的清除不僅受層析的條件的影響，還與目標(biāo) mAb 自身性質(zhì)有關(guān)。

本文綜述了常用柱層析的病毒清除能力，同時(shí)關(guān)注了病毒－mAb的相互作用對(duì)病毒清除的干擾。并簡(jiǎn)要討論了使用病毒替代物作為活病毒的安全替代品評(píng)估病毒清除率的潛力。

表 1 早期病毒清除研究使用的兩種病毒：X－MuLV 和 MVM

ProteinA 層析

ProteinA層析廣泛用于mAb的捕獲和初步純化，對(duì)mAb具有高選擇性，通常不截留病毒，因此猜測(cè)LRV會(huì)很高。但研究表明ProteinA層析病毒清除率反而較低（X－MuLV和MVM的平均LRV分別為2．98和2．32），且不同mAb的病毒清除率變異性高。當(dāng)工藝和mAb固定時(shí)，LRV具有高度可重復(fù)性，上樣濃度、流速、洗脫緩沖液摩爾濃度、洗脫 pH 和收集標(biāo)準(zhǔn)等幾個(gè)參數(shù)均不影響病毒清除率。同時(shí)，X－MuLV和MVM的去除存在正相關(guān)性，當(dāng)工藝和mAb固定時(shí)，當(dāng)X－MuLV清除率高時(shí)，MVM 清除率也高。

Bach和Connell－Crowley對(duì)ProteinA層析清除 X－MuLV 的研究很好的解釋了 ProteinA層析在病毒清除時(shí)的可重現(xiàn)性及高變異性。通過在層析柱上加載不同的樣品，LRV 從大到小依次是：僅含X－MuLV的溶液＞除去抗體的細(xì)胞收獲液＞含有抗體的細(xì)胞收獲液≈純化的mAb溶液。表明ProteinA層析中，mAb是決定LRV的主要因素，猜測(cè)比預(yù)期LRV低可能是由于病毒與mAb間存在相互作用，使其共同洗脫（圖 1）。

在洗脫液中增加有干擾相互作用的添加劑（如氯化鈉（1M）、精氨酸（750mM）、Triton（0．1％）和尿素（3M））可改善LRV，表明病毒－mAb間可能存在靜電、疏水或氫鍵等相互作用。由于X－MuLV尺寸相對(duì)較大（80－110nm）而僅主要結(jié)合在樹脂表面（ProteinA填料孔徑范為100－130nm），MVM因尺寸較�。�18－24nm），可進(jìn)入填料孔隙而與更多的mAb分子相互作用，因此LRV較低。

圖 1 ProteinA層析中病毒－mAb相互作用示意圖：大多數(shù)病毒在上樣過程中流穿，但有一小部分病毒因與mAb的相互作用被截留，而后隨樣品洗脫。

陰離子層析：AEX

多數(shù)mAb的等電點(diǎn)（pI）高于模型病毒的等電點(diǎn)，因此AEX通常采用流穿模式進(jìn)行病毒清除研究，即mAb流穿而等電點(diǎn)低的病毒結(jié)合在樹脂中。流穿模式下，AEX可有效去除包膜和非包膜病毒（X－MuLV和MVM的平均LRV分別為4．22和3．25）。由于病毒與AEX樹脂間的靜電作用，通常鹽濃度越低，LRV越高。

研究表明，在低鹽條件下，X－MuLV的LRV基本不受 pH（5．0－8．0）的影響，這與當(dāng) pH 為5時(shí)病毒應(yīng)與AEX樹脂結(jié)合的推理不符（X－MuLV的pI為5．8），推測(cè)該病毒在其表面上含有恒定的帶負(fù)電荷的區(qū)域。雖然 MVM的LRV隨著pH的增加而增加，但其在低于等電點(diǎn)的條件下清除效果低于預(yù)期�？梢妏I參數(shù)不足以預(yù)測(cè)作為病毒的大型復(fù)雜結(jié)構(gòu)與離子交換（IEX）樹脂的相互作用，更關(guān)鍵的是病毒表面電荷分布。AEX色譜法在較寬的參數(shù)范圍內(nèi)對(duì)病毒清除的穩(wěn)健性較好，一般來說，建議使用 pH7．0–8．5、電導(dǎo)率＜14mS／cm 和載量＜100mg／mL。

雖然 AEX 在病毒清除時(shí)穩(wěn)健性較好，但在推薦的條件下，仍會(huì)觀察到某些 mAb 的LRV較低的現(xiàn)象。推測(cè)是病毒表面的負(fù)電荷與帶正電荷的 mAb 相互作用，屏蔽了病毒表面的特征電荷，從而阻斷了病毒與樹脂結(jié)合，導(dǎo)致病毒與單克隆抗體共同流過（圖 2）。病毒－mAb 相互作用的強(qiáng)度不僅取決于 mAb 的pI和操作pH，難以預(yù)測(cè)。與 ProteinA層析不同，帶正電荷的AEX樹脂與mAb競(jìng)爭(zhēng)病毒結(jié)合，因此在 AEX層析中病毒－mAb相互作用對(duì)病毒清除的影響小于ProteinA層析。

圖 2 AEX流穿模式中，大多數(shù)病毒在上樣過程中與樹脂結(jié)合，但有一小部分病毒表面電荷因病毒與mAb的相互作用被屏蔽，不與樹脂結(jié)合而與 mAb 共流穿。

陽(yáng)離子層析：CEX

CEX是另一種廣泛用于精純步驟的層析，與AEX統(tǒng)稱為離子層析（IEX），通常采用結(jié)合－洗脫模式，通過線性或梯度性的增加鹽濃度洗脫樣品。Amgen公司研究表明，CEX可有效去除 X－MuLV、偽狂犬病病毒（PRV）和呼腸孤病毒3型病毒（Reo－3），但不能有效去除MVM。而操作pH是影響X－MuLV清除率的關(guān)鍵因素，pH5．0 時(shí)效果最好，當(dāng)pH增加至5．5或6．0時(shí)，LRV明顯降低， pH為6．5時(shí)幾乎無任何效果。這表明pH值是決定單抗／病毒選擇性的最關(guān)鍵因素。同時(shí)作者還證實(shí)了X－MuLV清除的主要機(jī)制是截留而不是失活即病毒在樣品洗脫過程中與樹脂結(jié)合。

也有研究表明病毒和樹脂之間的靜電相互作用在CEX介導(dǎo)的病毒去除中起主要作用。如AEX層析所示，mAb會(huì)流穿而大多數(shù)等電點(diǎn)低的病毒會(huì)與樹脂強(qiáng)烈結(jié)合。但 CEX中，在pH5．0下，X－MuLV與CEX樹脂的結(jié)合能力大于多數(shù) mAb，而與其等電點(diǎn)相近的MVM卻與CEX樹脂沒有明顯的結(jié)合。猜測(cè)是X－MuLV中存在與CEX樹脂產(chǎn)生相互作用的電荷簇，而MVM中沒有。雖然機(jī)制尚不清楚，但pH5．0的條件下，CEX可有效和穩(wěn)健的去除X－MuLV，且在此pH值下，病毒與CEX樹脂的結(jié)合增強(qiáng)，有助于通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合破壞潛在的病毒－mAb相互作用，進(jìn)一步有利于病毒去除。

有研究人員考慮用CEX替代ProteinA層析進(jìn)行病毒去除。在相似的條件下（即 pH5．0－5．7和電導(dǎo)率 3．0－6．0mS／cm），CEX在捕獲步驟的病毒清除效果不如精純步驟，但在一定的條件下可與 ProteinA層析相媲美。Connell－Crowley等研究表明，樣品中HCP含量對(duì)精純步驟CEX層析的X－MuLV去除幾乎沒有影響。用作精純步驟樣品的HCP含量（10－1850ppm）遠(yuǎn)低于細(xì)胞上清液中（高達(dá) 106ppm）。因此，當(dāng)CEX層析用作捕獲步驟時(shí)，樣品中大量的HCP與病毒競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合樹脂，從而導(dǎo)致病毒清除率下降。

CEX在過載模式下也可有效地去除X－MuLV。在過載模式下，層析柱的載量可以達(dá)到動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的10 倍。在這種模式下，mAb 可與緊密結(jié)合的雜質(zhì)分離。在過載模式下，CEX層析對(duì)X－MuLV、Reo－3、PRV和MVM均有清除效果。同時(shí)，流速／停留時(shí)間對(duì)病毒去除效率有很大影響，流速增加，LRV 降低。并且過載模式下的CEX層析的病毒清除效果與結(jié)合－洗脫模式相當(dāng)。

疏水層析（HIC）

除了IEX色譜法之外，基于疏水性分離蛋白質(zhì)的HIC是另一種精純步驟。HIC可以在結(jié)合洗脫或流穿模式下去除病毒，兩種模式下病毒均是通過結(jié)合到樹脂上而到達(dá)去除的目的，因此可選擇有利于病毒結(jié)合的HIC工藝。當(dāng)HIC樹脂一定時(shí)，上樣濃度、pH、線速度和電導(dǎo)率均會(huì)對(duì)病毒的清除有很大的影響。高電導(dǎo)率和低pH通常能增強(qiáng)病毒在HIC柱上的結(jié)合。高載量、高pH值、高流速和低電導(dǎo)率是往往是最不利于病毒去除。疏水性強(qiáng)的樹脂病毒去除能力更強(qiáng)，但收率較低。因此，在選擇HIC樹脂時(shí)，需要平衡病毒清除率和產(chǎn)品回收率兩個(gè)目標(biāo)。除此之外，病毒的表面疏水性不同也是影響因素之一，如 HIC 對(duì)疏水性強(qiáng)的X－MuLV清除強(qiáng)于疏水性較低的MVM。

混合模式層析

混合模式樹脂通常包含離子和疏水兩種官能團(tuán)。在低電導(dǎo)率和高電導(dǎo)率下，結(jié)合作用分別由電荷和疏水性主導(dǎo)。然而，結(jié)合作用通常不是兩種作用的簡(jiǎn)單疊加，而是離子和疏水相互作用的協(xié)同。與單模式樹脂相比，混合模式樹脂通常在較寬的 pH 和電導(dǎo)率范圍內(nèi)均有較高的病毒清除率。如流穿模式下，當(dāng)pH為 4．5－6．5，電導(dǎo)率為10－30mS／cm時(shí)，Capto adhere可有效的清除X－MuLV和MVM兩種病毒。

羥基磷灰石（HA）是一種獨(dú)特的混合模式樹脂，包含CEX和金屬親和性雙層特性。有研究表明，在6．7－7．8的pH條件下，HA層析對(duì)三種mAb中X－MuLV和PRV的清除率基本一致，而猿病毒40（SV40）的清除率因mAb不同而有所差異。分配研究表明，HA層析主要是通過上樣過程和洗脫過程中病毒和樹脂結(jié)合而清除病毒，且不同的mAb對(duì)同一病毒表現(xiàn)出不同的截留作用，表明病毒－mAb相互作用對(duì)于病毒的結(jié)合有影響。據(jù)報(bào)道，聚乙二醇（PEG）的添加可提高HA層析的病毒清除，其機(jī)制類似于聚集體的去除。

值得注意的是，混合模式層析在病毒去除方面是否可以直接等同于其他單模式層析（如IEX或HIC）取決于具體情況，難以一概而論。例如，一項(xiàng)研究表明，POROS HQ（AEX）和 Capto adhere（MIX）兩種層析的X－MuLV清除率基本一致（兩種樹脂都含有季銨化聚乙烯亞胺基團(tuán)）。而另一方面，POROS HQ 和 Capto adhere 的MVM清除率分別為 2．85 和＞6．8，因此混合模式層析的MVM清除率較高。

病毒替代物

病毒清除研究一般使用活病毒，由經(jīng)過培訓(xùn)的人員在專業(yè)設(shè)施中實(shí)施，因此限制了在工藝開發(fā)過程中直接評(píng)估單元操作的病毒清除能力。因此更便宜和更安全的非感染性病毒替代物作為活病毒的替代品被開發(fā)出來，特別是MVM的主要衣殼蛋白重組表達(dá)產(chǎn)生的MVM的非感染性病毒樣顆粒（VLPs），其與MVM有相似的物理化學(xué)性質(zhì)（大小、表面電荷和疏水性），有望成為 MVM 的替代品。多數(shù)研究表明：這種MVM模擬病毒顆粒（MVP）在AEX，HIC及親和層析上觀察到的病毒清除率差異一致。

此外，MVP還可替代MVM研究病毒－mab的相互作用，主要采用交聯(lián)層析法（cross－interaction chromatography），即通過交聯(lián)將多個(gè)單抗單獨(dú)固定在層析樹脂上，然后將MVP和固定的單抗加入層析柱上，在不同的單抗偶聯(lián)柱上MVP保留曲線不同，表明病毒與不同的單抗的相互作用不同。它證實(shí)了之前的結(jié)論，即病毒－mab相互作用在ProteinA層析清除病毒中發(fā)揮重要作用。

總結(jié)

不同的層析步驟往往表現(xiàn)出不同的病毒清除能力和穩(wěn)健性，即使穩(wěn)健的步驟（如AEX），mAb不同時(shí)也會(huì)觀察到清除率的變化。ProteinA層析中病毒與mAb的相互作用影響病毒清除率，可添加破壞相互作用的兩種或多種添加劑提高病毒清除率。除 ProteinA 層析外的步驟（如IEX、HIC 和混合模式），主要通過結(jié)合病毒實(shí)現(xiàn)清除，且選擇有利于病毒與樹脂結(jié)合的工藝條件通常會(huì)提高病毒清除率。同時(shí)這些步驟中的樹脂與mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合病毒，使得病毒－mAb 相互作用對(duì)病毒清除的影響小于 ProteinA層析。同時(shí)，病毒替代物的MVP的出現(xiàn)，不僅可以用于病毒清除研究，還可用于研究病毒－mAb之間的相互作用。

參考文獻(xiàn)：

1．Li YiFeng． Viral removal by column chromatography in downstream processing of monoclonal antibodies［J］． Protein Expression and Purification， 198

       原文標(biāo)題 : 柱層析法去除單克隆抗體中的病毒