關(guān)注小藥說藥，一起成長！

前言

基于T細(xì)胞的免疫療法的出現(xiàn)顯著改變了癌癥患者的治療模式。盡管取得了成功，但目前批準(zhǔn)的免疫治療方案仍然存在局限性。因此，需要對T細(xì)胞活化和抑制的分子機(jī)制有更深入的了解，以合理地擴(kuò)大改善免疫治療的靶點(diǎn)和可能性。

免疫信號通路下游的蛋白質(zhì)泛素化對于幾乎所有免疫反應(yīng)，特別是T細(xì)胞激活的正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。大量研究表明，泛素化通過控制蛋白質(zhì)的功能、定位和穩(wěn)定性發(fā)揮多種細(xì)胞和分子作用，對泛素依賴性通路的調(diào)節(jié)可以顯著改變T細(xì)胞的活化并增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。因此，人們正在積極開發(fā)有選擇性地利用泛素相關(guān)酶用于癌癥治療的技術(shù)，靶向泛素化為推進(jìn)T細(xì)胞免疫治療提供了巨大的可能性。

蛋白質(zhì)泛素化

泛素化是一種翻譯后修飾，泛素是一種由76個氨基酸組成的小蛋白質(zhì)，通常由一條泛素鏈與底物蛋白質(zhì)內(nèi)的賴氨酸殘基共價連接。泛素化通過各種方式影響蛋白質(zhì)功能，例如通過影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、周轉(zhuǎn)率、細(xì)胞定位，以及誘導(dǎo)影響與其他蛋白質(zhì)相互作用的構(gòu)象變化。

該過程由E1泛素激活酶啟動，該酶使用ATP激活，然后將泛素單體轉(zhuǎn)移到E2泛素結(jié)合酶。泛素最終在E3泛素連接酶的作用下從E2轉(zhuǎn)移到底物。

泛素化是多方面的，底物蛋白可以僅用一個泛素（單泛素化）、多個單泛素（多個單泛素化）或多泛素鏈（多泛素化）標(biāo)記。由于泛素本身有七個賴氨酸（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）和一個N端甲硫氨酸殘基（M1），可以進(jìn)行泛素化，因此可以形成幾種結(jié)構(gòu)不同的同質(zhì)／同型、混合／異型和分支多泛素鏈。

泛素化除了是通過蛋白質(zhì)體降解蛋白質(zhì)的主要調(diào)節(jié)器外，實(shí)際上是幾乎所有細(xì)胞信號級聯(lián)的多功能調(diào)節(jié)器。泛素化蛋白質(zhì)的命運(yùn)取決于添加的泛素數(shù)量和形成泛素連接的泛素氨基酸。通過這種方式，并且由于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同鏈的多種可能性，泛素構(gòu)成了一種高度通用的信號。

單泛素化和多泛素化參與膜受體的內(nèi)吞作用，以及蛋白質(zhì)降解、定位和蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，這些類型的鏈也與TGF－β信號傳導(dǎo)有關(guān)。在同型多泛素鏈中， Lys48和Lys63連接的鏈?zhǔn)亲钬S富，它們分別驅(qū)動蛋白酶體降解和調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號事件。Lys11連接鏈調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和線粒體自噬，M1連接鏈對炎癥固有反應(yīng)至關(guān)重要，特別是調(diào)節(jié)NF－κB信號。

由Lys6－、Lys27－、Lys29－、Lys33泛素連接鏈調(diào)節(jié)的細(xì)胞過程仍然不太清楚。Lys27連接鏈似乎對調(diào)節(jié)先天免疫、細(xì)胞周期和線粒體功能非常重要。Lys6鏈似乎參與DNA修復(fù)和線粒體自噬，而Lys29鏈與Wnt信號以及蛋白毒性應(yīng)激和細(xì)胞周期相關(guān)。Lys33鏈在高爾基體后轉(zhuǎn)運(yùn)和T細(xì)胞受體（TCR）調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。

此外，非常重要的是，泛素在底物上的組裝可以通過去泛素化酶（DUB）的作用逆轉(zhuǎn)，去泛素化酶水解并從底物上去除泛素，使泛素化成為一種瞬時修飾，DUB對于維持生理性泛素平衡是必不可少的。這種平衡的失調(diào)與人類疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，特別是癌癥、感染、神經(jīng)退行性變和免疫紊亂，因此，DUB已開始作為基于抑制劑的治療成為有吸引力的藥物靶點(diǎn)。

TCR／CD3激活中的泛素途徑

E3連接酶

E3泛素連接酶Casitas B系淋巴瘤（Cbl－B）是最具特征的E3連接酶，是T細(xì)胞活化的主要參與者。在T細(xì)胞激活時，它在免疫突觸處被招募到TCR中，在TCR下游發(fā)揮多種抑制機(jī)制。

Cbl－b通過其多個蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域與關(guān)鍵TCR信號體分子（如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K）相互作用。Cbl－b與E3連接酶Itch協(xié)同作用，能夠介導(dǎo)TCR－ζ的Lys33連接的多泛素化，其不針對TCR受體進(jìn)行降解或內(nèi)吞，而是阻止其磷酸化并進(jìn)一步與下游ZAP70激酶結(jié)合。通過這些相互作用，以及一些信號體成分的泛素化，Cbl－b強(qiáng)烈抑制T細(xì)胞活化。Cbl－b敲除小鼠具有過度活躍的T細(xì)胞，其激活不需要CD28，此外，Cbl－b基因敲除小鼠中從未描述過自身免疫損傷。因此，Cbl－b具有多個檢查點(diǎn)抑制作用和極小的自身免疫毒性，是未來靶向癌癥免疫治療的有力候選。

與淋巴細(xì)胞無能相關(guān)的基因（GRAIL）是一種跨膜E3連接酶，定位于內(nèi)體，也對T細(xì)胞活化起負(fù)調(diào)節(jié)作用。TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化促進(jìn)GRAIL的表達(dá)，而GRAIL反過來又阻礙T細(xì)胞活化。機(jī)制上，GRAIL通過非降解泛素鏈穩(wěn)定和激活Rho－鳥嘌呤解離抑制劑（RhoGDI），導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排和IL－2分泌缺陷。

NRDP1是另一種損害TCR信號的E3連接酶。T細(xì)胞激活后，NRDP1將Lys33多聚泛素非降解鏈添加到ZAP70激酶。Lys33連接的泛素鏈有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶，最終使ZAP70去磷酸化和失活。

除了作用于近端信號體外，E3連接酶還通過進(jìn)一步作用于下游抑制T細(xì)胞活化，控制導(dǎo)致T細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子核易位的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。例如，在TCR／CD28連接后，E3連接酶Pellino1（PELI1）通過用Lys48多泛素鏈標(biāo)記c－Rel來阻止NF－κB通路，導(dǎo)致其蛋白酶體降解。

DUBs

去泛素化酶A20和CYLD，在調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞中的NF－κB信號中具有重要作用，也能顯著改變T細(xì)胞功能。外周T細(xì)胞中A20的條件性缺失導(dǎo)致CD8＋T細(xì)胞具有增強(qiáng)的NF－κB信號，即使在低抗原劑量下也能更有效地被激活，以產(chǎn)生更高水平的IL－2和IFN－γ。

CYLD可以通過NF－κB損害T細(xì)胞活化，它是通過將CBM復(fù)合物下游TAK1激酶的Lys63泛素鏈進(jìn)行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出現(xiàn)結(jié)腸炎，T細(xì)胞頻率和活化增加。

使用類似的作用機(jī)制，去泛素酶USP18對TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失導(dǎo)致T細(xì)胞中NF－κB和NFAT的過度激活和IL－2的過度產(chǎn)生。相反，去泛素酶USP9X和USP12通過從BCL10中去除抑制性泛素鏈來積極調(diào)節(jié)NF－κB通路，從而阻斷CBM信號復(fù)合物的組裝。因此，缺乏USP9X或USP12的T細(xì)胞在TCR激活時表現(xiàn)出較低水平的NF－κB激活，以及增殖和細(xì)胞因子生成減少。

TCR內(nèi)化

TCR信號幅度和持續(xù)時間由細(xì)胞膜受體的內(nèi)化、再循環(huán)和降解的平衡決定。在抗原刺激下，TCR／CD3復(fù)合物是泛素化的，而泛素化對于表面受體的內(nèi)化至關(guān)重要。據(jù)報道，Cbl－b可單獨(dú)或與E3連接酶c－Cbl聯(lián)合促進(jìn)TCR的內(nèi)化，Cbl－b還干擾激活和聚集，從而破壞免疫突觸的穩(wěn)定性，進(jìn)一步減弱TCR信號。

類似地，E3連接酶GRAIL可以通過蛋白酶體多泛素化和降解CD3ζ分子來下調(diào)表面TCR／CD3復(fù)合物的表達(dá)。最近的研究表明，用于CAR－T治療的CAR受體的表面表達(dá)也受到泛素介導(dǎo)的內(nèi)吞和降解的影響。注入患者體內(nèi)的CAR－T細(xì)胞持續(xù)性差是這種腫瘤免疫療法的主要限制。最近的一項(xiàng)研究能夠通過對細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的所有賴氨酸殘基進(jìn)行突變來提高CAR的穩(wěn)定性，這有效地繞過了CARs的泛素化依賴性溶酶體降解，因此，這些CAR－T細(xì)胞改善了CAR的持久性和來自內(nèi)體的信號傳導(dǎo)，同時增強(qiáng)了效應(yīng)器功能，從而在小鼠模型中產(chǎn)生持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

共刺激受體下游的泛素途徑

CD28

E3連接酶Cbl－b是CD28介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的主要抑制劑，從機(jī)制上講，E3連接酶Cbl－b通過結(jié)合和泛素化PI3K的p85β亞單位來抑制CD28依賴的PI3K途徑。

E3連接酶不僅能阻礙CD28信號傳導(dǎo)，而且能促進(jìn)CD28信號傳導(dǎo)。例如，TCR／CD28激活NFAT涉及E3連接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突觸與支架蛋白LAT相互作用，并通過Lys63泛素化增強(qiáng)LAT磷酸化和TCR信號。

為了充分激活T細(xì)胞，CD28共受體必須克服Cbl－b抑制。CD28信號通過觸發(fā)Cbl－b的翻譯后修飾來阻斷Cbl－b抑制途徑，最終導(dǎo)致其蛋白酶體降解。其中E3連接酶NEDD4發(fā)揮著重要作用，據(jù)報道NEDD4在CD28共刺激下結(jié)合并泛素化Cbl－b進(jìn)行蛋白酶體降解。

其他共刺激受體

與CD28類似，腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族成員的共刺激受體4－1BB、CD40L、OX40和GITR與TCR協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞活化，尤其是增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。作為TNFRs，它們?nèi)狈��?nèi)在的酶功能，依賴于幾種E3連接酶，包括TRAF（TRAF1／2／3）、cIAP1／2和LUBAC，在導(dǎo)致NF－κB活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中引導(dǎo)大量Lys63、Lys48和線性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除這些泛素化事件以阻止NF－κB的活化。

抑制性受體下游泛素途徑

CTLA－4

到目前為止，沒有任何E3直接泛素化CTLA－4的報道，也沒有CTLA－4中泛素化位點(diǎn)的記錄。然而，CTLA－4缺陷型T細(xì)胞的泛素修飾總體上顯著減少，這有力地表明了泛素化事件在CTLA－4途徑中的重要性。此外，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，主要CTLA－4抑制功能由關(guān)鍵的T細(xì)胞抑制性E3連接酶介導(dǎo)，該連接酶也調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，即Cbl－b、ITCH和GRAIL。

此外，Cbl－b、ITCH和GRAIL是T細(xì)胞無能的基本驅(qū)動因素，而且這三種E3連接酶還通過調(diào)節(jié)Treg的發(fā)育和功能發(fā)揮重要的免疫抑制作用。Cbl－b和ITCH參與TGF－β介導(dǎo)的Foxp3調(diào)節(jié)，缺乏這兩種E3連接酶都會損害TGF－β誘導(dǎo)的Foxp3＋Tregs（iTreg）的發(fā)育，導(dǎo)致iTreg低表達(dá)，功能缺陷。

PD－1

與CTLA－4不同，一些報告強(qiáng)調(diào)了泛素化在PD－1／PD－L1系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。對于T細(xì)胞上的PD－1受體，Cbl－b也作為PD－1抑制途徑的關(guān)鍵介質(zhì)顯著參與，缺乏Cbl－b的T細(xì)胞對PD－1抑制具有抵抗力。沒有Cbl－b，PD－1在抑制IFN－γ產(chǎn)生或誘導(dǎo)T細(xì)胞活化后的細(xì)胞死亡方面效率低下。

另一種Cbl E3連接酶c－Cbl也影響PD－1，但與Cbl－b相反，它是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子。c－Cbl與PD－1的胞質(zhì)尾部結(jié)合，并作為E3連接酶，泛素化PD－1進(jìn)行蛋白酶體降解。因此，c－Cbl減少提高了CD8＋T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中PD－1的表達(dá)。

同樣，E3連接酶FBXO38通過介導(dǎo)PD－1降解來控制T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。從機(jī)理上講，F(xiàn)BXO38通過在Lys233處添加Lys48多聚泛素鏈來標(biāo)記PD－1進(jìn)行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和結(jié)直腸癌小鼠模型具有更高的腫瘤負(fù)荷，這與腫瘤浸潤性T細(xì)胞中PD－1的高表達(dá)有關(guān)。

PD－L1

PD－L1的腫瘤水平是腫瘤免疫的重要決定因素。幾項(xiàng)研究已確定癌細(xì)胞利用EGFR信號穩(wěn)定PD－L1表達(dá)以逃避T細(xì)胞免疫。E3連接酶識別并泛素標(biāo)記PD－L1進(jìn)行蛋白水解，主要依賴于糖原合成酶激酶3（GSK3α／β）。GSK3β磷酸化PD－L1的C端結(jié)構(gòu)域，以招募E3連接酶β－TrCP用于PD－L1泛素依賴性降解。而EGFR信號通過誘導(dǎo)GSK3β磷酸化位點(diǎn)附近的PD－L1大量糖基化來對抗GSK3β／β－TrCP／PD－L1降解途徑。

另一項(xiàng)研究進(jìn)一步表明GSK3α／ARIH1是另一種誘導(dǎo)PD－L1蛋白水解的激酶／E3連接酶對。E3連接酶ARIH1識別S279／S283處PD－L1的GSK3α依賴性磷酸化，隨后PD－L1 Lys48泛素化和降解。最近，還發(fā)現(xiàn)EGFR通過額外干擾膜結(jié)合MARCH8 E3連接酶增加PD－L1水平，該連接酶也以PD－L1為降解靶點(diǎn)。最后，c－Cbl過表達(dá)，單獨(dú)或與Cbl－b聯(lián)合，也可以降低STAT3／AKT／ERK磷酸化，從而下調(diào)PD－L1表達(dá)并增加抗腫瘤反應(yīng)。

Cullin3 SPOP和TRIM21E3連接酶通過泛素化依賴性降解進(jìn)一步破壞PD－L1的穩(wěn)定性，它們的作用再次依賴于激酶，特別是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和CDK5。然而，CDK4通過穩(wěn)定Cullin3 SPOP協(xié)助PD－L1降解，而CDK5則消極干擾TRIM21對PD－L1的作用。

此外，PD－L1也因其他幾種去泛素化酶而穩(wěn)定，即OTUB1、USP9X、USP7。這些研究具有潛在的治療意義，因?yàn)樗鼈冏C明，抑制或清除這些DUB中的任何一種都可以重新激發(fā)小鼠的抗腫瘤反應(yīng)，并使癌細(xì)胞對T細(xì)胞殺傷敏感。

泛素依賴途徑腫瘤藥物的開發(fā)

到目前為止，針對泛素依賴的途徑主要是基于小分子抑制劑，這些小分子可以通過直接結(jié)合或變構(gòu)作用阻斷泛素相關(guān)酶的催化結(jié)構(gòu)域，或阻止其與底物或其他調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合。目前，已經(jīng)開發(fā)了200多種化合物，其中許多化合物正在進(jìn)行癌癥治療的臨床前和臨床試驗(yàn)。

大多數(shù)基于泛素的小分子化合物被設(shè)計成靶向癌細(xì)胞中必需的泛素途徑。隨著以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療的出現(xiàn)，針對選擇性E3和DUB的靶向抑制已有研究，其中關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)檢查點(diǎn)T細(xì)胞抑制劑Cbl－b具有巨大的潛力。已有研究利用RNA干擾成功地下調(diào)了T細(xì)胞中的Cbl－b水平，這在不同的過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移腫瘤模型中產(chǎn)生了出色的體外和臨床前結(jié)果，并且癌癥患者對其耐受性良好，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)（NCT02166255和NCT03087591）。此外，針對IAPs、MDM2和USP7的小分子已經(jīng)進(jìn)行了臨床前試驗(yàn)，并證明單獨(dú)使用或聯(lián)合使用時，至少部分增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫。

調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中PD－L1降解的泛素化依賴途徑也正在進(jìn)行測試。例如，一種競爭性棕櫚�；�抑制劑（CPP－S1），以防止PD－L1棕櫚�；�，進(jìn)而促進(jìn)PD－L1泛素介導(dǎo)的降解。控制PD－L1泛素化和降解的EGFR信號通路也通過不同的方式在體內(nèi)被有效阻斷，包括EGFR小分子抑制劑、銅螯合劑和靶向CSN5的小分子，都顯著增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。

基于鄰近性的治療方法，包括PROTAC或分子膠技術(shù)，也正在迅速發(fā)展，以針對幾種特定腫瘤蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解，目前有十幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在驗(yàn)證這些基于泛素化技術(shù)的治療潛力。

小結(jié)

數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)幾種泛素依賴性途徑，特別是所涉及的泛素依賴性酶，可以釋放強(qiáng)烈、持久和靶向的抗腫瘤反應(yīng)。目前，泛素領(lǐng)域也取得了巨大進(jìn)展，開發(fā)出了多種新技術(shù)和新方法，可以專門針對幾乎所有泛素依賴的酶，或者利用它們針對感興趣的底物蛋白，包括腫瘤蛋白。展望未來，相信這些重要的泛素依賴途徑的調(diào)節(jié)很快將成為改善靶向腫瘤免疫治療的可行替代方案。

參考文獻(xiàn)：

1．Ubiquitination in T－Cell Activation andCheckpoint Inhibition： New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy． Int J MolSci． 2021 Oct； 22（19）： 10800．

       原文標(biāo)題 : T細(xì)胞活化和檢查點(diǎn)抑制中的泛素化