前言

人類基因組計(jì)劃(HGP)揭示了人類基因組的大量信息,并大大增強(qiáng)了其在生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)展中的作用。由于下一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,研究人員已經(jīng)能夠揭示一些遺傳因素在許多疾病中的作用,如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森病和阿爾茨海默病。

此外,許多研究的成果已經(jīng)揭示了編碼和非編碼RNA(ncRNAs)的重要作用,如miRNA、長(zhǎng)ncRNAs(lncRNA)、circRNA和siRNAs。這為通過將核酸引入細(xì)胞以永久或瞬時(shí)控制改變基因的表達(dá)來開發(fā)各種疾病的可能治療方法奠定了基礎(chǔ)。此外,通過各種遞送系統(tǒng)的開發(fā)可以將RNA運(yùn)送到目標(biāo)位點(diǎn),解決了RNA固有的不穩(wěn)定性帶來的問題。因此,許多涉及siRNA、ASO、核酶、mRNA、適配體和CRISPR/Cas的基于RNA的療法已經(jīng)開發(fā)出來,并正在各種疾病中進(jìn)行臨床試驗(yàn)。基于RNA的藥物展現(xiàn)出卓越的應(yīng)用潛力。

SiRNA

siRNA是由核糖核酸酶Dicer通過內(nèi)切過程產(chǎn)生的,這是一種屬于RNase III家族的內(nèi)切酶,可以產(chǎn)生21-25核苷酸雙鏈RNA。一旦產(chǎn)生,Dicer將siRNA轉(zhuǎn)移到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC),該復(fù)合物包含降解靶mRNA分子的Argonaute 2。由于siRNA的這種能力,它們被作為一種可能的治療方法。

SiRNA療法正在多種癌癥治療中進(jìn)行測(cè)試。siG12D-LODER是一種可生物降解的聚合物基質(zhì),含有針對(duì)KRASG12D的siRNA,臨床研究(NCT01188785)表明,該聚合物能夠靶向腫瘤并抑制腫瘤進(jìn)展。目前,正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究(NCT01676259),以測(cè)試siG12D-LODER與化療藥物(如吉西他濱和nab紫杉醇)聯(lián)合治療局部晚期胰腺癌患者的療效。

Polo樣激酶(PLK)參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖并通常在癌細(xì)胞中過表達(dá),抑制Plk可減少癌細(xì)胞增殖。TKM-080301是一種脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑,由四種脂質(zhì)和一種針對(duì)人類PLK1 mRNA的合成雙鏈siRNA組成。靜脈輸注TKM-080301顯示出良好的耐受性,但在晚期肝細(xì)胞癌患者中僅顯示出有限的抗腫瘤作用,且沒有總體生存效應(yīng)。然而,TKM-080301在腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)中顯示出一定的腫瘤抑制作用。

蛋白激酶N3(PKN3)是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)途徑的下游效應(yīng)器,阻斷PKN3可以抑制腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Atu027,一種脂質(zhì)體PKN3 siRNA制劑,在晚期實(shí)體瘤患者中安全性良好,在治療結(jié)束時(shí),41%的受試者病情穩(wěn)定。在隨后的研究中,Atu027和吉西他濱聯(lián)合治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌顯示出良好的安全性和耐受性。

除了癌癥領(lǐng)域,SiRNA在其它疾病領(lǐng)域的應(yīng)用也在積極開發(fā)。Inclisiran,是一種硫代磷酸酯、2′-O-甲基核苷酸和2′-氟核苷酸修飾的siRNA,靶向PCSK9,皮下注射已證明可降低高心血管風(fēng)險(xiǎn)患者的PCSK9水平和LDL膽固醇水平。并且僅半年注射一次,顯示出極佳的患者依從性。2020年12月11日,Inclisiran獲歐盟批準(zhǔn)上市。

許多siRNA研究針對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性(CNV-AMD)引起的脈絡(luò)膜新生血管,以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(VEGFR1)或RTP801為靶點(diǎn)的研究,在臨床試驗(yàn)的各個(gè)階段都顯示了有希望的結(jié)果,如AGN211745和PF-04523655。此外,QPI-1007,一種抑制caspase 2表達(dá)的siRNA,在視神經(jīng)萎縮患者中顯示出良好的耐受性和視力的改善。

此外,包括常染色體隱性遺傳原發(fā)性高草酸尿癥(PHs)、乙型肝炎病毒(HBV)和肝臟和特發(fā)性肺纖維化中,SiRNA療法均展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

ASO

反義核酸(ASO)是18-30個(gè)堿基對(duì)的單鏈RNA/DNA分子,設(shè)計(jì)用于特異性抑制mRNA功能。它們與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合,通過RNase H阻礙mRNA翻譯或降解mRNA。

ASO在眼部疾病的治療,許多臨床前和臨床試驗(yàn)都顯示了有希望的結(jié)果。Leber先天性黑矇(LCA)由于包括中心體蛋白290(CEP290)在內(nèi)的各種基因的內(nèi)含子突變,導(dǎo)致視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良,引起青少年失明或嚴(yán)重視力損害。QR-110是一種單鏈、硫代磷酸化、2′O-甲基修飾的剪接調(diào)節(jié)RNA寡核苷酸,用于靶向CEP290。臨床研究(NCT03140969和NCT03913143)顯示,玻璃體內(nèi)注射QR-110可以重建LCA患者成纖維細(xì)胞中的CEP290水平,并具有良好的耐受性和安全性。

適配體

適配體是結(jié)合和抑制蛋白質(zhì)的單鏈核酸(DNA或RNA)分子。適配體形成形狀的能力提供了對(duì)目標(biāo)的高親和力和極好的特異性,由于其作用模式與抗體相似,適配子也被稱為化學(xué)抗體。目前,多種適配體已進(jìn)入各種疾病的臨床試驗(yàn),如黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫和慢性炎癥性疾病。

EYE001是VEGF的聚乙二醇化適配體,在體外模型中顯示出完全減少VEGF介導(dǎo)的血管滲漏、抑制視網(wǎng)膜新生血管的能力,從而改善視力。在CNV-AMD患者中進(jìn)行的EYE001單用或聯(lián)合光動(dòng)力療法的研究中顯示出明顯的視力穩(wěn)定或改善。

除了VEGF外,補(bǔ)體途徑在AMD中也起著重要作用。Zimura,一種聚乙二醇化的單鏈核酸適配體靶向補(bǔ)體因子C5以及pegcetacoplan靶向C3和C3b,它們的臨床研究表明,皮下注射能夠減少繼發(fā)于AMD的地圖樣萎縮(GA),而不會(huì)發(fā)生不良事件。

此外,ARC1779是一種靶向vWF A1結(jié)構(gòu)域的適配體,在臨床試驗(yàn)(NCT00632242)中,ARC1779顯示出良好的耐受性以及抑制血栓性血小板減少性紫癜患者vWF依賴性血小板功能的能力。Emapticap-pegol(NOX-E36)是一種靶向CCL2的適配體,在伴有蛋白尿的2型糖尿病患者中,皮下注射Emapticap顯示出良好的耐受性和抑制CCL2/CCL2受體軸的能力。

核酶

核酶是催化RNA的分子,與靶RNA雜交并導(dǎo)致RNA降解,從而抑制特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。重要的是,核酶可以在沒有細(xì)胞蛋白的情況下發(fā)揮作用。

RPI．4610(Angiozyme)是一種化學(xué)穩(wěn)定的抗VEGFR-1核酶,與卡鉑和紫杉醇聯(lián)合用于晚期實(shí)體瘤患者,已證明具有良好的安全性、生物利用度和腫瘤定位能力。然而,它未能在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中證明臨床療效。

OZ1是tat-vpr特異性抗HIV核酶,通過自體CD34+細(xì)胞遞送,在臨床試驗(yàn)(NCT00074997)中顯示CD4+淋巴細(xì)胞顯著增加,表明細(xì)胞遞送的基因轉(zhuǎn)移在維持核酶的安全性和活性方面同樣可靠。

盡管在許多臨床試驗(yàn)中取得了成功,但也有一些研究報(bào)告表明缺乏有效性和安全性,例如胃腸道癌患者中靶向人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)編碼RNA的Ad5CRT、轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的血管酶或嵌合核酶。因此,核酶在穩(wěn)定性、體內(nèi)活性、共定位、輸送到特定細(xì)胞以及持續(xù)穩(wěn)定和長(zhǎng)期表達(dá)方面仍需改進(jìn)。

mRNA

以mRNA為基礎(chǔ)的治療代表了一個(gè)相對(duì)新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效,這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。

傳染病疫苗是目前mRNA療法中最領(lǐng)先的應(yīng)用。Moderma和輝瑞的新冠疫苗已經(jīng)在數(shù)十億人群中證明了安全性和有效性,展現(xiàn)出未來強(qiáng)大的應(yīng)用前景,這里不多贅述。(參閱

目前,針對(duì)腫瘤的mRNA疫苗有2種方式:i)使用體外負(fù)載或電穿孔的DC,ii)通過直接注射帶有或不帶有載體的mRNA。

在癌癥患者中應(yīng)用了幾項(xiàng)基于DC的mRNA疫苗的臨床試驗(yàn),用編碼黑色素瘤相關(guān)抗原的mRNA與TriMix聯(lián)合接種導(dǎo)致晚期黑色素瘤令人印象深刻的腫瘤消退。目前mRNA疫苗正在向聯(lián)合治療方法發(fā)展,包括化療、放療和檢查點(diǎn)抑制劑。其中一些研究產(chǎn)生了持久的腫瘤生長(zhǎng)抑制。盡管這些基于DC的方法是有效的,但是它們也受限于繁瑣的程序和高昂的成本。

相比之下,直接注射裸mRNA或復(fù)合mRNA被認(rèn)為是一種快速有效的可行方法。例如,一項(xiàng)I/II期試驗(yàn)在30例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者皮內(nèi)反復(fù)應(yīng)用編碼6種不同TAA(MUC1、CEA、Her2/neu、telomerase、survivin、MAGE-A1)的mRNA疫苗。10年后的長(zhǎng)期結(jié)果表明,mRNA疫苗是安全有效的。它延緩了腫瘤生長(zhǎng)并提高了生存率,這與檢測(cè)到的針對(duì)TAAs的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

另一項(xiàng)研究中,7名局部晚期患者和39名轉(zhuǎn)移性NSCLC患者接受了5次皮內(nèi)注射CV9201,這是一種編碼5種NSCLC抗原(NY-ESO-1、MAGE-C1/2、survivin、5T4)的活性疫苗。63%的患者產(chǎn)生了針對(duì)至少一種抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答,60%的患者表現(xiàn)出激活的IgD+CD38high B細(xì)胞增多。31%的患者疾病穩(wěn)定(SD),另外三分之二的患者病情進(jìn)展。一項(xiàng)旨在提高抗腫瘤免疫力的類似研究檢測(cè)了晚期NSCLC患者接種CV9202聯(lián)合局部放療的情況。

CV9202是一種基于RNA的活性疫苗,編碼6種NSCLC TAA(NY-ESO-1、MAGE-C1、MAGE-C2、5T4、survivin和MUC-1)。與基線相比,大多數(shù)患者的抗原特異性細(xì)胞免疫和體液免疫增強(qiáng)。一名接受疫苗、放療和化療的患者出現(xiàn)部分緩解(PR),46．2%的患者獲得SD。

mRNA-4157疫苗是美國(guó)Moderna公司研發(fā)的一款mRNA疫苗,它是一種針對(duì)每位腫瘤患者量身定制的個(gè)體化腫瘤疫苗,目前mRNA-4157癌癥疫苗能夠容納高達(dá)34個(gè)編碼新抗原的mRNA序列。在mRNA-4157聯(lián)合Keytruda的I期臨床試驗(yàn)中,13例接受單藥治療的患者中有11名患者保持疾病穩(wěn)定。在聯(lián)合治療組中,20例患者中有6例獲得響應(yīng),其中包括1例完全緩解和5例部分緩解。6名患者疾病穩(wěn)定,8名病情惡化。與mRNA-4157相關(guān)的所有不良事件都是可逆的,并且是輕微的。沒有觀察到與治療有關(guān)的≥3級(jí)不良事件,證明了疫苗的安全性和耐受性。目前,有多項(xiàng)腫瘤mRNA疫苗處于臨床招募階段。

CRISPR/Cas9

CRISPR- Cas9系統(tǒng)是一種細(xì)菌防御機(jī)制,利用引導(dǎo)RNA(gRNA)介導(dǎo)DNA內(nèi)切酶Cas9在靶DNA中引入位點(diǎn)特異性斷裂。這種DNA編輯能力使得CRISPR-Cas9通過合成sgRNA在基因組修飾中用作RNA治療劑,用于生物和治療應(yīng)用。

許多研究表明CRISPR/Cas9可用于治療遺傳性疾病,如囊性纖維化(CF)、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)、血紅蛋白病以及HIV和β-地中海貧血。在一項(xiàng)研究中,CRISPR/Cas9能夠增加肌管中的utrophin數(shù)量并去除重復(fù)的DMD外顯子18–30,從而在DMD中產(chǎn)生全長(zhǎng)dystrophin。

在β-地中海貧血中,人類血紅蛋白β(HBB)基因的突變可以通過CRISPR/Cas9糾正。通過piggyBac轉(zhuǎn)座子,患者來源的IPSC中的CRISPR/Cas9有效地糾正了HBB突變,而不影響IPSC的多能性,并在分化為紅細(xì)胞時(shí)恢復(fù)了HBB的表達(dá)。此外,CRISPR-Cas9的類似應(yīng)用也已在艾滋病等免疫疾病中得到證實(shí)。

盡管這些研究為未來的CRISPR-Cas9臨床試驗(yàn)提供了基礎(chǔ),但在CRISPR/Cas9進(jìn)一步應(yīng)用于臨床試驗(yàn)和隨后的治療之前,仍有一些挑戰(zhàn)有待解決。包括向靶細(xì)胞遞送基因編輯工具可能的靶外效應(yīng)。此外,在將CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)化為治療應(yīng)用之前,還需要考慮CRISPR-Cas9的倫理問題和種系應(yīng)用。

小結(jié)

近年來,以RNA為基礎(chǔ)的療法逐漸成為各種疾病的潛在干預(yù)策略。一般來說,RNA療法根據(jù)其作用方式和使用的分子分為不同的類別。許多RNA療法已被開發(fā)用于各種疾病,并且在許多臨床前和臨床研究中獲得非常有希望的結(jié)果,尤其是mRNA疫苗成為目前最火熱的研究領(lǐng)域之一。目前,基于RNA的療法依然存在許多障礙,包括遞送系統(tǒng)在內(nèi)的許多方面仍需要得到進(jìn)一步的研究和開發(fā),然而不可否認(rèn),未來十年屬于RNA治療的時(shí)代終將到來。

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