前言

腫瘤免疫治療旨在激活宿主的抗腫瘤免疫，形成腫瘤抑制微環(huán)境，最終實現(xiàn)消除腫瘤，提高患者的整體生存率。腫瘤疫苗是一種很有前途的抗腫瘤免疫治療手段。針對腫瘤相關抗原（TAAs）或腫瘤特異性抗原（TSAs）的疫苗可以特異性攻擊和摧毀這些抗原高水平表達的惡性腫瘤細胞，并通過免疫記憶實現(xiàn)持續(xù)的腫瘤殺傷。因此，與其他類型的免疫治療相比，癌癥疫苗理論上可以提供特異、安全和耐受性良好的治療效果。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會整合到基因組中，從而避免了對插入突變的擔憂；mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造，從而實現(xiàn)快速、經(jīng)濟、高效的生產(chǎn)。此外，單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強針對適應性病原體的免疫反應，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

mRNA疫苗是一類重要的癌癥疫苗，能夠編碼和表達TAA、TSA及其相關細胞因子。mRNA癌癥疫苗可以刺激體液免疫和細胞免疫，提高這些疫苗對不同疾病和患者的適應性。目前，多種mRNA癌癥疫苗正在臨床中進行開發(fā)，為癌癥免疫治療帶來新的曙光。

mRNA疫苗制備策略

體外轉錄（IVT）mRNA模擬內源性mRNA的結構，有五個部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR），一個編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結構包含一個7－甲基鳥苷核苷，5′端結構會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側的5′和3′UTR調節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位，來自高表達基因（如α－和β－珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外，UTR可根據(jù)細胞類型進行優(yōu)化，如通過去除3′UTR中的miRNA結合位點和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過優(yōu)化密碼子，從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS－CoV－2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗階段。

為了最大化翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1－甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別，保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS－CoV－2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略，由CureVac首創(chuàng)，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進外，在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質粒在體外轉錄。另外，使用CleanCap的共轉錄封蓋技術，簡化了純化步驟。

mRNA遞送系統(tǒng)

由于mRNA較大（104–106Da）且?guī)ж撾姡�因此無法通過細胞膜的陰離子脂質雙層。此外，在體內，它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內應用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質納米顆粒（LNP）

脂質納米顆粒是臨床上最先進的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準臨床使用的SARS－CoV－2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質，它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。

可電離脂質與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質帶正電荷并吸引RNA。此外，它們在內涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷，這促進了它們與內涵體膜的融合，將其釋放到細胞質中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質。通過設計提高DODMA的功效，產(chǎn)生了DLin－MC3－DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin－MC3－DMA還用于mRNA的遞送。

目前，學術界和工業(yè)界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質，包括C12－200、503O13、306Oi10、OF－02、TT3、5A2－SC8、SM－102（用于抗SARS－CoV－2的Moderna疫苗mRNA－1273）和ALC－0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

除了尋求提高療效外，人們越來越關注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質11－A－M58，和含有環(huán)咪唑頭的脂質93－O17S59，已被設計用于體內靶向T細胞。盡管機制尚不清楚，但這些脂質的環(huán)狀基團對于靶向T細胞至關重要。

盡管電離脂質可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質成分（膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質）也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質，它通過填充脂質之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細胞的過程中與內涵體膜融合。

輔助脂質通過促進有助于膜與內涵體融合的脂質相變來調節(jié)納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質的選擇取決于可電離脂質材料和RNA載體。例如，對于類脂質材料，飽和輔助脂質（如DSPC）最適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質（如DOPE）最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS－CoV－2疫苗mRNA－1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質（如DMPE或DMG）結合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP，通過限制脂質融合調節(jié)納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA－1273和BNT162b2 SARS－CoV－2疫苗均含有聚乙二醇化脂質。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進展不如LNP，但聚合物具有與脂質相似的優(yōu)勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物，可通過內吞作用進入細胞。

聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應用。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β－氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉運體（CARTs），它能有效地靶向T細胞，操縱T細胞是非常困難的，因此，CART 是一種極具吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細胞中，這要歸功于其主鏈和側鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結合并形成納米復合物。例如，含有重復的精氨酸－丙氨酸－亮氨酸－丙氨酸（RALA）基序的膜融合細胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。

最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細胞，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質中的機制尚不清楚。

mRNA疫苗的免疫作用

在注射mRNA癌癥疫苗后，mRNA編碼的蛋白質由核糖體合成，然后翻譯后修飾以產(chǎn)生正確折疊的功能蛋白質，并呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)。該過程類似于RNA病毒感染和連續(xù)誘導保護性免疫反應的自然過程。外源mRNA進入細胞質導致與內源性mRNA類似的反應。

誘導先天免疫反應

宿主免疫系統(tǒng)通過PRRs檢測病原體相關分子模式（PAMP）激活固有免疫反應。注射疫苗后，mRNA和傳遞系統(tǒng)成分將通過一系列PRR識別為外源性物質，導致Toll樣受體（TLR）的激活，例如主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被細胞膜、內體以及細胞質中的各種PRR識別，并在刺激內源性免疫反應中發(fā)揮作用。

IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介導。TLR7由B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表達，并介導識別單鏈RNA（ssRNA）的過程。在細胞質中，其他一些PRR可以感應不同類型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。

在非免疫細胞中，細胞質維甲酸誘導基因I樣受體（RLR）和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）感應外源mRNA并調節(jié)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，導致天然免疫細胞募集到mRNA注射部位。

誘導適應性免疫反應

mRNA疫苗接種后，編碼的蛋白質將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)，并刺激適應性免疫。mRNA編碼的蛋白質通過內吞或吞噬作用被APC吸收，它們可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的內體，抗原蛋白通過樹突狀細胞上的主要組織相容性復合體呈遞。

mRNA癌癥疫苗通常編碼在癌細胞上表達的TAA。這些TAA可進一步分為組織分化抗原（如MART－1）、腫瘤生殖系抗原（如NY－ESO－1或MAGE－3）、腫瘤細胞過表達的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2／neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和腫瘤特異性突變抗原（如MUM－1、β－catenin或CDK4）。此外，體細胞突變可能產(chǎn)生新抗原表位，碼新抗原的mRNA疫苗被認為是最佳的候選癌癥疫苗。

除了誘導T細胞免疫外，mRNA疫苗還誘導中和抗體。濾泡輔助性T細胞（Tfh）不僅對生發(fā)中心的發(fā)育至關重要，而且還驅動免疫球蛋白樣轉化、親和力成熟和持久的B細胞記憶反應。這些細胞可以被mRNA疫苗激活，產(chǎn)生足夠數(shù)量有效和持久的中和抗體。

mRNA癌癥疫苗的臨床開發(fā)

基于IVT mRNA的疫苗正在逐步開發(fā)，用于多種腫瘤治療。目前，mRNA癌癥疫苗根據(jù)最終產(chǎn)品類型可以分為編碼TAA、TSA、細胞因子和抗體的癌癥疫苗。

編碼TAAs 的mRNA疫苗

在多項臨床試驗中，NY－ESO－1、酪氨酸酶、MAGE－A3、MAGE－C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。

BNT111是一種BioNTechFixVac平臺開發(fā)癌癥疫苗，該平臺利用TAA的固定組合，旨在觸發(fā)針對癌癥的強大而精確的免疫反應。2021年底，F(xiàn)DA批準了BNT111快速通道資格，這是一種治療晚期黑色素瘤的新型癌癥免疫療法，目前BNT111正在兩項臨床試驗中進行研究。一項I期試驗（NCT02410733）的中期分析報告表明，BNT111是有效的免疫療法。隨后的II期試驗（NCT04526899）研究BNT111單獨或與抗PD－1抗體cemiplimab聯(lián)合的安全性和有效性。

CV9201和CV9202是兩種針對非小細胞肺癌中表達的靶抗原的mRNA疫苗。臨床試驗（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，這兩種疫苗耐受性良好，治療后可以檢測到免疫反應，從而支持在非小細胞肺癌中的進一步臨床研究。

編碼TSA的mRNA疫苗

編碼多種突變抗原的mRNA疫苗是治療突變誘發(fā)的惡性腫瘤的理想疫苗，這種類型的癌癥疫苗進行的臨床試驗最多。隨著下一代測序技術的發(fā)展，可以生產(chǎn)編碼突變抗原的個性化mRNA癌癥疫苗，這種個性化的癌癥疫苗具有非常誘人的前景。

兩種個性化mRNA癌癥疫苗目前正在進行二期臨床試驗，即Moderna的mRNA－4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA－4157在單個mRNA分子上特異性篩選和編碼20－34個新抗原，這取決于患者的癌癥突變。一期試驗（NCT03313778）的中期數(shù)據(jù)表明，mRNA－4157單藥治療或與PD－1抑制劑Keytruda聯(lián)合治療在所有測試劑量下都具有良好的耐受性，并引發(fā)新抗原特異性T細胞反應。該疫苗目前正在黑色素瘤患者進行二期臨床試驗（NCT03897881）。BioNTech 的BNT122已經(jīng)探索了與PD－L1抗體聯(lián)合治療的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小細胞肺癌和大腸癌的II期臨床試驗已于2021上半年啟動。

mRNA編碼免疫刺激劑

理論上，mRNA癌癥疫苗可以編碼任何蛋白質，包括免疫刺激劑，其可以重塑腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），克服腫瘤免疫耐受，這已成為mRNA腫瘤疫苗研究的一個重要方向。

在過去幾年中，已經(jīng)進行了編碼細胞因子的mRNAs癌癥疫苗的臨床試驗。目前，臨床試驗中只有七種候選產(chǎn)品，它們屬于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna開發(fā)了第一個表達mRNA編碼的免疫刺激劑（mRNA－2416），其編碼OX40L，一項1期臨床試驗（NCT03323398）評估了mRNA－2416單獨和與durvalumab聯(lián)合的安全性和耐受性。已有的數(shù)據(jù)表明，mRNA－2416單藥在所有劑量水平下都是可耐受的，沒有報告劑量限制毒性，大多數(shù)相關不良事件為1級或2級。更重要的是，在PD－L1上調的時間內觀察到廣泛的促炎活性和有益的變化。目前，mRNA－2416瘤內注射已進入晚期卵巢癌的臨床II期試驗。

另一種mRNA疫苗mRNA－2752編碼OX40L／IL23／IL36γ，早期的臨床結果表明，mRNA－2752與抗PD－L1抗體durvalumab聯(lián)合使用，在所有劑量下都具有良好的耐受性，并顯示出抗腫瘤活性的跡象。

此外，BioNTech還開發(fā)了編碼IL－12sc、IL－15sushi、GM－CSF和IFNα的BNT131，其作為單一療法或與cemiplimab聯(lián)合用于晚期實體瘤患者。

小結

幾十年來，mRNA設計和核酸遞送技術的進步，加上新抗原靶點的發(fā)現(xiàn)，使得mRNA疫苗成為對抗癌癥的有力工具。mRNA疫苗的優(yōu)勢體現(xiàn)在mRNA癌癥疫苗具有同時編碼多種抗原的能力，以及非整合、高度降解和無插入突變潛力。IVT產(chǎn)生的mRNA不含細胞和致病性病毒成分，沒有感染的可能性；在正在進行的臨床試驗中測試的大多數(shù)mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特異性免疫反應很少。

快速生產(chǎn)是mRNA癌癥疫苗的另一個優(yōu)勢，并且mRNA制造技術的成熟允許在短時間內生產(chǎn)新型疫苗。最近新抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定促進了個性化疫苗治療的發(fā)展。BioNTech和Moderna進行的幾項臨床研究表明，在一些治療多發(fā)性實體瘤的臨床試驗中，使用個性化疫苗具有強大的抗腫瘤免疫，開創(chuàng)了治療性腫瘤疫苗的新時代。我們有理由認為，mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學的疫苗接種方法以及癌癥免疫療法。

       原文標題 : mRNA疫苗：癌癥免疫治療新時代的曙光