FEP是什么？對小分子的藥物設計有什么幫助？FEP適合fast－follow／first－in－class的項目么？

在回答這些問題以前，我們先來糾正一個很多人會犯的一個錯誤：

CADD（計算機輔助藥物設計）里的分子對接（docking）是藥物設計人員最常使用的功能。據我所知，有不少人會將計算結果的打分值（Scoring）作為分子好壞的標準。

下圖來源于薛定諤公司Dr． Jenny Chambers的《Introduction to Structure－Based Drug Design》。圖里說的很清楚，對接的打分結果和活性（IC50，Kd，EC50）無關，也不能用來對分子的好壞進行排序，僅能作為富集分子的工具。

Docking因為其打分函數(shù)不準確以及采樣不足限制了這種方法的精度。有其他的CADD工具可以實現(xiàn)么？可以比較準確的預測化合物的活性（結合自由能）？比如基于分子動力學的MM／PB（GB）SA？

浙江大學藥學院的侯廷軍教授在這一領域研究多年，在最新的Review中（Chem． Rev． 2019， 119， 16， 9478–9508），侯教授認為MM／PB（GB）SA在小分子藥物研發(fā)中的作用主要有兩類：①基于對接的虛擬篩選后的再評估②精確分析小分子－蛋白質的相互作用。

關于MM／PB（GB）SA的預測精度，文章中是這么說的：

＂However， they cannot serve as a basis for developing more accurate methods and predict true drug candidates in drug design without experimental verification because of their relatively limited accuracy （compared with FEP and TI）．＂

這也和其他業(yè)內專家的觀點一致，“對于MM／PB（GB）SA的預測能力是不做預期的”

那FEP和TI又是什么呢？

FEP：Free energy perturbation（自由能微擾）

TI：Thermodynamic integration（熱力學積分）

FEP、TI以及MM／PB（GB）SA都是常用的自由能計算方法，關于FEP／TI【自由能專題1：原理與方法】文章中是這樣介紹的：

自由能微擾法：Free Energy Perturbation （FEP） 和熱力學積分法：Thermodynamic Integration （TI）。這類方法從原理上來講比較嚴格，計算結果也較為準確，但需要長時間的數(shù)據采集，對計算體系有嚴格的限制，只能適合較為簡單，而且這類方法一般只能計算兩個配體之間相對結合自由能，因此在以往的藥物設計中的應用受到了很大的限制，但是得益于近些年計算機性能的迅猛發(fā)展，由于這類方法計算的準確度高，已成為藥物設計中的研究自由能的主流方法。

而兩者又有一定的差別：TI 是對FEP的模擬數(shù)據的另一種分析方法，分子動力學模擬的軌跡和能量數(shù)據，經過FEP或TI分析，計算出過程的自由能變。而 TI 的缺陷在于，其原理上難以分析通過REST2等增強采樣方法獲得的數(shù)據，因此限制了在結合模式復雜、口袋柔性大的復合物等場景的應用。TI暫且不表。

FEP的理論基礎最早可以回溯到1930年代的Peierls的工作（Eur． Phys． J． A 1933， 80， 763?791），1954年，美國馬里蘭大學的理論物理學家和化學家Robert Zwanzig推導出了FEP的主方程：

自由能微擾（FEP）方法直到1980年代才引起計算機輔助藥物設計（CADD）領域的關注：1986年，休斯頓大學的J． Andrew McCammon發(fā)表了題為“Dynamics and Design of Enzymes and Inhibitors”的文章（J． Am． Chem． Soc． 1986， 108， 13， 3830–3832），這代表著FEP方法在CADD領域首次應用。1989年，加州大學舊金山分校的Peter Kollman教授首次進行了FEP的前瞻性研究，對三肽類嗜熱菌蛋白酶抑制劑的活性進行了預測（J． Am． Chem． Soc． 1989， 111， 15， 5649–5658）。

解釋下：關于FEP的回顧性研究（Retrospective study）和前瞻性研究（Prospective study）區(qū)別：回顧性研究是先有實驗數(shù)據，后再進行FEP計算，是一種驗證性的工作；前瞻性研究是先有FEP計算，后再進行實驗驗證，是一種預測性的工作。

隨后，F(xiàn)EP方法在學術界得到了進一步的應用，比如耶魯大學William L． Jorgensen教授在20世紀初開始，發(fā)表了多篇運用FEP方法輔助Xa因子抑制劑／非核苷類HIV－1逆轉錄酶抑制劑研發(fā)的文章。

不過，受制于力場的準確性、采樣算法的效率以及算力，一直沒有在制藥工業(yè)界獲得廣泛的運用。隨著力場、采樣算法、算力等方面的發(fā)展，薛定諤公司在2014年發(fā)布了商業(yè)化FEP計算工具FEP＋。

隨后薛定諤公司在2015年的JACS上發(fā)表了關于FEP計算預測親和力的重磅文章（J． Am． Chem． Soc． 2015， 137， 2695?2703），他們針對8個靶點／199個小分子配體的親和力進行了預測，并且和實驗值進行比較，達到了非常高的相關性。下圖的虛線代表 1．0 kcal／mol的誤差，折算下來是5－10倍的IC50活性差距：這意味著FEP最終實現(xiàn)了藥物設計人員夢寐以求的、化學精度的預測。

同時，文章中也對比了對接打分（Glide SP）和MM－GBSA預測的相關性，結果顯而易見。

再解釋下：或許很多人會疑惑結合自由能和活性（Ki，Kd，IC50）到底啥關系？【CADD ｜ 自由能微擾簡介】這篇文章給出了詳細的解釋，由于公式太過復雜，僅截取部分內容，有興趣的閱讀全文哈。

關于自由能提升（kcal／mol）和活性改善相關性的詳細計算過程見圖，來源，B站：

隨著薛定諤上述文章的發(fā)表，可被工業(yè)界應用的FEP技術引起了各大制藥公司的興趣，2016年的5月和8月，各大制藥公司進行了多次的FEP研討會，并將討論的內容和結論發(fā)表在期刊上（J Comput Aided Mol Des，2016， 30， 1139–1141）。

上述的制藥公司包括：默克／輝瑞／安進／拜耳／強生／諾華／BMS／GSK／福泰

各大BigPharma不僅僅是感興趣，發(fā)現(xiàn)真的好用，可以加速研發(fā)之后，也逐漸將FEP作為重要的新藥研發(fā)工具，并發(fā)表了多篇有影響力的期刊文章。

比如，輝瑞的科學家利用FEP技術對17個不同五并六元雜環(huán)骨架的SYK抑制劑進行預測，并通過實驗得到驗證，得到了細胞活性提高10倍的化合物（ChemMedChem 2016， 11， 217 – 233）。

羅氏的科學家在JMC上發(fā)表了一篇很有意思的文章（J． Med． Chem． 2017， 60， 6， 2485–2497）。為了探索組織蛋白酶L的S2口袋，依據不同的伯胺共構建了3325個分子的化合物庫。利用四種方法進行篩選，分別是①FEP計算（FEP＋），②藥物化學家基于之前SAR進行的挑選（MC，Med Chem），③專家通過結合模式以及相互作用的分析，進行人工挑選（MM，SBDD），④基于MAB力場優(yōu)化的對接來預測的分子結合模式，再經過人工挑選（DOMF，Docking）。

經過實驗測試之后的結果，下圖更直觀。和reference化合物相比，F(xiàn)EP篩選出來的化合物實驗結果更好，10個化合物有8個超過reference，遠遠超過其他三種方法。

強生的科學家在進行PDE2A抑制劑開發(fā)的hit－to－lead階段，利用FEP預測了265個設計的分子，并最終合成了100個化合物，經過生物測試評估，得到了高活性、高選擇性、高BBB滲透、in vivo驗證的先導化合物46（J． Med． Chem． 2020， 63， 21， 12887–12910）。

文章中，也對比了FEP和docking的效果，直接搬運下：

＂FEP correctly identified 90％ （9 out of 10） of the 10 most active amongst its best ranked 10， compared to 20％ （2 out of 10） from docking．＂

阿斯利康的科學家在EED抑制劑的后期優(yōu)化階段，利用FEP對苯并二氫呋喃環(huán)上7位的R取代基（下圖）進行了預測，并通過實驗驗證，得到了理化性質／細胞活性提高的化合物（Bioorg． Med． Chem． Lett． 39 （2021） 127904）。

默克的科學家最近發(fā)表了非常重要的利用FEP加速研發(fā)的回顧性文章（J． Chem． Inf． Model． 2020， 60， 11， 5457–5474）。詳細的介紹參見【自由能方法及應用（二）結合自由能計算在默克藥物研發(fā)實踐中的大規(guī)模前瞻性評估】。這里直接搬運一下部分內容：

“從2016年到2019年，作者前瞻性地將FEP＋應用于12個靶點和23個化合物系列，進行了超過35，000個獨立擾動計算。最終，作者獲得了6，000多個化學實體的有效預測，合成和測試了400多個預測得到的新穎分子，產生了大量的前瞻性數(shù)據，提供了該方法在典型小分子藥物發(fā)現(xiàn)的實際流程中準確性的詳細評估�！�

拜耳在2014年底就在內部的研發(fā)中部署了FEP＋，截止2016年的數(shù)據，已有80％的項目、多達16個靶點使用了FEP，40％的化學家會經常使用FEP計算（2016 Workshop on Free Energy Methods in Drug Design）。

葛蘭素史克的科學家同樣在2016年的workshop上披露了內部使用FEP的情況。超過800個化合物進行了FEP計算，下圖左則是8個項目251個化合物實驗值／預測值擬合的情況，可以看到大部分化合物的預測還是相當準確的（2016 Workshop on Free Energy Methods in Drug Design）。

優(yōu)時比（UCB BioPharma）的Zara Sands博士在European Alchemical Free Energy Workshop 2019會議上介紹了優(yōu)時比內部使用FEP的經驗和具體案例。

各大BigPharma已經廣泛的、深入的使用FEP功能，F(xiàn)EP計算也已成為藥物研發(fā)必備工具之一了；那眾多的Biotech公司呢？

薛定諤就不用說了吧，作為最早推出商用化FEP工具“FEP＋”的Biotech，不僅發(fā)表了大量的高水平的FEP文章，加速了自由能計算領域的發(fā)展；并且在新藥項目中，早已把FEP＋運用的爐火純青，并且陸續(xù)開發(fā)了諸如protein FEP，AL－FEP等研發(fā)利器。

很多Biotech公司（Nimbus、Agios、碩迪生物 etc）或者BigPharma（禮來、賽諾菲）和薛定諤合作的項目中，也借助了薛定諤的FEP＋等計算工具。

RAPT Therapeutics的科學家在FEP的幫助下，得到了高體外／體內活性的USP7抑制劑（J． Med． Chem． 2020， 63， 5398?5420）。

Blueprint Medicines的Aysegul Ozen博士在Free Energy Workshop 2020上介紹使用FEP和protein FEP加速激酶抑制劑研發(fā)的具體案例，建議去Youtube上找來看看，非常棒的分享（Youtube搜索Aysegul Ozen）。

此外，Aysegul Ozen還介紹了他們驗證和部署FEP的情況，目前已經在內部5個項目中成功應用了FEP。

Silicon Therapeutics在STING抑制劑研發(fā)過程中，從近2萬個分子中，經過相對自由能計算（FEP）預測，最終挑選了200個分子進行合成，并最終獲得了臨床候選分子SNX281（Youtube，Physics－Driven Discovery of SNX281）；SNX281正在進行和K藥聯(lián)用的抗腫瘤一期臨床研究。

Relay therapeutics則把自由能計算（FEP）作為Dynamo?平臺中Physics－based simulations的重要組成模塊。

那FEP到底能做什么？

自由能微擾（Free Energy Perturbation，F(xiàn)EP）計算可用來預測同系物的相對結合自由能變化。在FEP計算中，分子通過非物理（“煉金術”）途徑逐漸轉變?yōu)榻Y構上密切相關的類似物。通過對這些互相轉化的終態(tài)之間的自由能差（ΔΔG）的計算評估，可以獲得與實驗值相比約1kcal／mol的預測精度。下圖即為相對自由能計算的熱力學循環(huán)圖，也是FEP計算重要的基本原理。

FEP的典型應用場景有哪些？這里借用下薛定諤公司的Presentation。

簡單說，就兩類：①提升化合物的活性；②保持化合物活性的基礎上優(yōu)化其他成藥性質。

所以，回到文章開始的問題，fast－follow／first－in－class的項目是非常適合用FEP的。

FEP算的到底準不準呢？

雖然已經有眾多公司在使用FEP加速新藥研發(fā)了，但是我想很多人看到這里最大的疑問還是FEP算的準不準？

首先，F(xiàn)EP已是業(yè)界公認的精度最高的計算結合自由能的方法，換句話說，就是目前預測活性最準的方法了，已經有非常多的研究文獻確證了這一點。

其次，F(xiàn)EP計算的精度受多種因素影響。

例如：強生的科學家在用FEP指導優(yōu)化BACE1抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)FEP預測的準確度和MD的模擬時長（1ns～20ns；2ns～40ns）密切相關（J． Chem． Theory Comput． 2017， 13， 1439?1453 ／ J． Chem． Inf． Model． 2016， 56， 9， 1856–1871）。

例如：強生的科學家們在開發(fā)脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象（J． Chem． Theory Comput． 2018， 14， 5815?5822）。抑制劑左右兩邊片段（下圖虛線方框）用FEP預測的準確性是不一樣的，左邊共32個化合物，相關系數(shù)0．79；右邊共16個化合物，相關系數(shù)只有0．02。

例如：強生（對，還是強生）的科學家在優(yōu)化PDE2抑制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)苯環(huán)／吡啶環(huán)上的取代基大小會影響蛋白質中Leu770的朝向和水分子的有無（下圖），而晶體復合物中的這種細微差別對FEP計算的預測準確性有非常大的影響（Sci Rep． 2018 20；8（1）：4883．）。

例如：力場的影響（Free Energy Workshop 2016）：

例如：復合物的影響（Alchemical Free Energy Workshop 2019）：

更多的影響因素討論，建議精讀上文提到的默克的科學家發(fā)表的利用FEP加速研發(fā)的回顧性文章（J． Chem． Inf． Model． 2020， 60， 11， 5457–5474）。

借業(yè)內專家的觀點總結一下，影響FEP計算精度的因素有很多，主要可以分為2個方面的因素：

①算法和程序方面的因素：力場參數(shù)的準確性，采樣算法的效率，perturbation scale的設計，?些極端情況下的特殊算法穩(wěn)定性，模擬時長等。

②使用者經驗方面的因素：復合物初始結構的準確性，Ligands變化的幅度，Ligands Alignment和Atom Mapping的合理性檢查，Perturbed Network的設計等。

關于算的準不準，再放張默克的圖吧（Workshop on Free Energy 2018）。圖片里的曲線是Gartner技術成熟度曲線，也可以說是關于認知的達克效應曲線。默克使用FEP兩年之后的summary可以這樣解讀：

Technology Trigger － 技術啟蒙 －－ 原來FEP代表的是這個意思，可以這樣用～

Peak of Inflated Expectations － 期望膨脹之巔 －－牛X，最準的計算方法

Trough of Disillusionment － 質疑、絕望之谷 －－ 在我的項目上預測的根本不準啊，是不是騙人的啊～

Slope of Enlightenment － 開悟之坡 －－ 原來應該這樣用，要這樣設置；果然，算的很準～

Plateau of productivity － 加速研發(fā) －－ 所有合適的項目分子合成前，先用FEP算一把；開搞～

總之，F(xiàn)EP是個非常好的工具，但是也需要學習、實踐如何去用好它，發(fā)揮它的最大價值。

看到這里，也許你想試試FEP，那如何開始FEP計算呢？

（這里指前瞻性計算，理想情況下最好先做下回顧性計算）

簡單的說，你需要準備

1． 含有小分子的某靶點共晶復合物（最好有，或經過專家復核的高精度對接結果）。

2． 基于共晶復合物中小分子而設計的、結構類似的新分子

然后就需要一款可以進行FEP計算的專業(yè)軟件了，比如，商業(yè)化的軟件：薛定諤的FEP＋、Cresset的Flare V3；或者開源軟件，比如分子動力學模擬軟件Gromacs。

再或者， 你也許可以考慮下深勢科技的Uni－FEP

Uni－FEP能夠能夠兼顧CADD專家及藥物化學的先導化合物優(yōu)化需求，提供：

1． 一站式自動化的蛋白準備、配體準備、計算力場參數(shù)、分配電荷、弛豫與平衡體系的全自動工作流的端對端服務，最小化用戶工作；

2． 更精確且適配的分子力場

3． 多種配體對齊方式

4． 自動生成微擾圖，且微擾圖可自定義修改；

5． REST2增強采樣，提高精度與效率；

6． 基于 MBAR 統(tǒng)計方法計算相對結合自由能

7． 計算結果的多種可視化、交互式分析

8． 可擴展的計算資源

9． 相比FEP＋，更高的性價比；

10． 與Hermite其他功能組成完整的從靶點結構到苗頭化合物篩選，再到先導化合物優(yōu)化的整體解決方案；

11． 完善的售后服務及專家交流群

簡而言之，Uni－FEP作為為國內最早公開發(fā)布測試的FEP計算模塊（可能也是國內既“看”的到，也用的到、屈指可數(shù)的FEP產品），深勢科技團隊在算法設計、動力學引擎等方面儲備大量的研發(fā)經驗，尤其在前面提到的影響FEP計算精度的力場和采樣方面形成了比較顯著的技術壁壘，同時深勢科技的產品團隊對計算流程中大量的指令操作充分優(yōu)化，開發(fā)了易用簡潔的可視化界面，使其真正具備了“工業(yè)級”的工具能力。

國內已經有多家企業(yè)開始使用Uni－FEP：翰森、恩華、泓博、加科思，更多的合作企業(yè)即將披露～